$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dell'antigene per iniezione sottocutanea
- Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione all'interno di una cappa chimica per prevenire l'inalazione o il contatto della pelle con la polvere di Mycobacterium tuberculosis, Mtb H37Ra. Maneggiare secondo le politiche istituzionali per l'adiuvante di Freund completo (tipicamente BSL-1). Ciò include l'uso di guanti resistenti agli agenti chimici, occhiali di sicurezza e indumenti da lavoro protettivi (camice da laboratorio).
- Utilizzare una buona tecnica sterile per prevenire la contaminazione dei reagenti che verranno introdotti negli animali da esperimento.
- Preparare la sospensione di Mtb in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mescolando 5 mg di polvere di Mycobacterium tuberculosis H37Ra liofilizzata e uccisa a caldo con 2,5 mL di PBS freddo in una provetta da microcentrifuga da 5 mL. Agitare una volta per 30 secondi e poi mettere sul ghiaccio.
- Per generare una sospensione fine dell'H37Ra in PBS, sonicare la sospensione sul ghiaccio per 5 minuti.
- Sbloccare il corpo dell'unità convertitore e pulire la sonda con un tampone imbevuto di alcol al 70% (v/v).
- Accendere il sonicatore, regolare l'impostazione della potenza su 4 ruotando la manopola di controllo dell'alimentazione e immergere la punta della sonda nella polvere micobatterica contenente PBS. Assicurarsi che la punta della sonda sia immersa ad almeno la metà della profondità del campione e che la punta della sonda non tocchi la parete della provetta per microcentrifuga.
- Sonicare la miscela con ghiaccio per 30 secondi, fare una pausa per 30 secondi e ripetere per un totale di 5 minuti per disperdere completamente la polvere in una sospensione uniforme senza riscaldare il liquido.
- Aggiungere 2,5 ml di adiuvante incompleto di Freund alla miscela e ripetere il processo di sonicazione con ghiaccio fino a quando l'emulsione non forma una consistenza simile a quella di un dentifricio.
- Impostare l'alimentazione su 0 utilizzando la manopola di controllo e spegnere l'unità per terminare la sonicazione. Rimuovere la punta dalla sospensione e pulire la sonda con un tampone imbevuto di alcol.
- Conservare l'emulsione dell'antigene a 4 °C. La preparazione di lotti dell'emulsione aiuterà a garantire la coerenza tra gli esperimenti. L'emulsione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 3 mesi.
2. Iniezione sottocutanea
- Eseguire l'iniezione sottocutanea una settimana prima dell'iniezione intravitreale (indicata come giorno -7).
- Caricare una siringa da 1 ml (senza ago) con l'emulsione micobatterica. A causa della viscosità e dell'opacità dell'emulsione, bolle d'aria difficili da vedere possono riempire la siringa.
- Per evitare la formazione di bolle d'aria nella siringa, dopo aver caricato 0,2-0,3 ml di emulsione, capovolgere la siringa (punta rivolta verso l'alto) e picchiettare delicatamente la siringa ripetutamente sul bordo di un bancone per portare le bolle in superficie.
- Espellere l'aria dalla siringa e continuare a riempire la siringa. Capovolgere e picchiettare a intermittenza fino a riempirlo.
- Posizionare un ago da 25 G sulla siringa e far avanzare l'emulsione fino a riempire l'ago. Conservare la siringa in ghiaccio fino al momento dell'utilizzo.
- Per eseguire l'iniezione sottocutanea in sicurezza, anestetizzare il topo o utilizzare metodi di contenzione umana che consentano un facile accesso ai quarti posteriori dell'animale.
- Per anestetizzare per l'iniezione sottocutanea, posizionare l'animale in una camera di induzione dell'isoflurano (3%-4% per l'induzione e 1%-3% per il mantenimento). Una volta anestetizzato, assicurarsi che il topo abbia una frequenza respiratoria lenta e non mostri segni di distress respiratorio.
- Posizionare le iniezioni sottocutanee sulla superficie dorsale delle anche o sulla superficie ventrale delle gambe prossimale alla regione dei linfonodi inguinali.
- Inserire con cautela l'ago per evitare l'iniezione nel muscolo. Iniettare 0,05 mL di emulsione di Mtb nello spazio sottocutaneo. Non rimuovere immediatamente l'ago per consentire l'iniezione completa dell'emulsione densa.
- Ripetere l'iniezione su entrambi i lati sinistro e destro per un totale di 0,1 ml per animale.
- In caso di anestetismo, posizionare il mouse su un termoforo caldo fino al completo recupero. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
- Rimettere il topo nella sua gabbia al termine della guarigione ed etichettare la scheda della gabbia con la data dell'iniezione sottocutanea.
- Fornire analgesia con paracetamolo orale (200 mg/kg/die), ma non con farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) poiché gli agenti antinfiammatori possono influire sull'induzione dell'uveite.