Un modello murino di uveite micobatterica innescata per studiare l'uveite post-infettiva

Abstract

Fonte: John, S., et al. Uveite micobatterica innescata (PMU) come modello per l'uveite post-infettiva. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video dimostra un metodo per generare un modello murino di uveite micobatterica innescata (PMU) per lo studio dell'uveite post-infettiva. Dopo l'induzione della PMU mediante iniezione intravitreale di Mycobacterium tuberculosis ucciso con il calore in un topo precedentemente immunizzato con lo stesso immunogeno, la progressione dell'infiammazione cronica nell'occhio viene analizzata mediante imaging ed esame istopatologico

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparazione dell'antigene per iniezione sottocutanea

1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione all'interno di una cappa chimica per evitare l'inalazione o il contatto della pelle con la polvere di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) H37Ra. Maneggiare secondo le politiche istituzionali per l'adiuvante di Freund completo (tipicamente BSL-1). Ciò include l'uso di guanti resistenti agli agenti chimici, occhiali di sicurezza e indumenti da lavoro protettivi (camice da laboratorio).
2. Utilizzare una buona tecnica sterile per prevenire la contaminazione dei reagenti che verranno introdotti negli animali da esperimento.
3. Preparare la sospensione di Mtb in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mescolando 5 mg di polvere di Mtb H37Ra liofilizzata e uccisa a caldo con 2,5 mL di PBS freddo in una provetta da microcentrifuga da 5 mL. Agitare una volta per 30 secondi e poi mettere sul ghiaccio.
4. Per generare una sospensione fine dell'H37Ra in PBS, sonicare la sospensione sul ghiaccio per 5 minuti.
   1. Sbloccare il corpo dell'unità convertitore e pulire la sonda con un tampone imbevuto di alcol al 70% (v/v).
   2. Accendere il sonicatore, regolare l'impostazione della potenza su 4 ruotando la manopola di controllo dell'alimentazione e immergere la punta della sonda nella polvere micobatterica contenente PBS. Assicurarsi che la punta della sonda sia immersa ad almeno la metà della profondità del campione e che la punta della sonda non tocchi la parete della provetta per microcentrifuga.
5. Sonicare la miscela con ghiaccio per 30 secondi, fare una pausa per 30 secondi e ripetere per un totale di 5 minuti per disperdere completamente la polvere in una sospensione uniforme senza riscaldare il liquido.
6. Aggiungere 2,5 ml di adiuvante incompleto di Freund alla miscela e ripetere il processo di sonicazione con ghiaccio fino a quando l'emulsione non forma una consistenza simile a quella di un dentifricio.
7. Impostare l'alimentazione su 0 utilizzando la manopola di controllo e spegnere l'unità per terminare la sonicazione. Rimuovere la punta dalla sospensione e pulire la sonda con un tampone imbevuto di alcol.
8. Conservare l'emulsione dell'antigene a 4 °C. La preparazione di lotti dell'emulsione aiuterà a garantire la coerenza tra gli esperimenti. L'emulsione può essere conservata a 4 °C per un massimo di 3 mesi.

2. Iniezione sottocutanea

1. Eseguire l'iniezione sottocutanea una settimana prima dell'iniezione intravitreale (IVT) (designata come giorno -7).
2. Caricare una siringa da 1 ml (senza ago) con l'emulsione micobatterica. A causa della viscosità e dell'opacità dell'emulsione, bolle d'aria difficili da vedere possono riempire la siringa.
   1. Per evitare la formazione di bolle d'aria nella siringa, dopo aver caricato 0,2-0,3 ml di emulsione, capovolgere la siringa (punta rivolta verso l'alto) e picchiettare delicatamente la siringa ripetutamente sul bordo di un bancone per portare le bolle in superficie.
3. Espellere l'aria dalla siringa e continuare a riempire la siringa. Capovolgere e picchiettare a intermittenza fino a riempirlo.
4. Posizionare un ago da 25 G sulla siringa e far avanzare l'emulsione fino a riempire l'ago. Conservare la siringa in ghiaccio fino al momento dell'utilizzo.
5. Per eseguire l'iniezione sottocutanea in sicurezza, anestetizzare il topo o utilizzare metodi di contenzione umana che consentano un facile accesso ai quarti posteriori dell'animale.
6. Per anestetizzare per l'iniezione sottocutanea, posizionare l'animale in una camera di induzione dell'isoflurano (3%-4% per l'induzione e 1%-3% per il mantenimento). Una volta anestetizzato, assicurarsi che il topo abbia una frequenza respiratoria lenta e non mostri segni di distress respiratorio.
7. Posizionare le iniezioni sottocutanee sulla superficie dorsale delle anche o sulla superficie ventrale delle gambe prossimale alla regione dei linfonodi inguinali.
   1. Inserire con cautela l'ago per evitare l'iniezione nel muscolo. Iniettare 0,05 mL di emulsione di Mtb nello spazio sottocutaneo. Non rimuovere immediatamente l'ago per consentire l'iniezione completa dell'emulsione densa.
   2. Ripetere l'iniezione su entrambi i lati sinistro e destro per un totale di 0,1 ml per animale.
8. In caso di anestetismo, posizionare il mouse su un termoforo caldo fino al completo recupero. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale.
9. Rimettere il topo nella sua gabbia al termine della guarigione ed etichettare la scheda della gabbia con la data dell'iniezione sottocutanea.
10. Fornire analgesia con paracetamolo orale (200 mg/kg/die), ma non con farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS) poiché gli agenti antinfiammatori possono influire sull'induzione dell'uveite.

3. Preparazione dell'antigene per l'iniezione intravitreale

1. Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni sterili appropriate per prevenire la contaminazione della sospensione intravitreale di Mtb.
2. Effettuare le sospensioni intravitreali.
   1. Per l'induzione di panuveite da lieve a moderata, preparare la sospensione intravitreale a una concentrazione di 5 mg/mL aggiungendo 5 mg di estratto di micobatteri a 1 mL di 1x PBS.
   2. Per l'induzione di panuveite da moderata a grave, preparare la sospensione intravitreale a una concentrazione di 10 mg/mL aggiungendo 10 mg di estratto di micobatteri a 1 mL di 1x PBS.
3. Agitare una volta per 30 secondi e poi mettere sul ghiaccio.
4. Per generare una sospensione fine dell'H37Ra in PBS, sonicare la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti come descritto al punto 1.4. Aliquotare questa soluzione madre in volumi di 100 μL e conservare a -20 °C.
5. Prima dell'uso, scongelare a temperatura ambiente e agitare alla massima potenza per 1 minuto. Mantenere le aliquote sul ghiaccio durante il trasporto alla struttura per animali.

4. Procedura di iniezione intravitreale il giorno 0

1. Preparazione degli animali
   1. Indossare guanti da esplorazione adatti e posizionare il mouse su una bilancia per ottenere il suo peso in grammi.
   2. Somministrare un'iniezione intraperitoneale di 0,02 mL/g di peso corporeo di una soluzione contenente 100 mg/mL di ketamina e 20 mg/mL di xilazina miscelata con acqua sterile per anestetizzare l'animale. Un approccio alternativo include l'induzione con isoflurano ~1,5% (inalato).
   3. Attendere circa 2 minuti affinché il mouse si addormenti, quindi posizionare il mouse in una scatola riscaldante e coprire il coperchio. Eseguire test del riflesso del dolore come il pizzicamento dell'orecchio, dei piedi e della coda per valutare la profondità dell'anestesia per la procedura.
   4. Una volta addormentato, anestetizzare la cornea con 1 goccia di tetracaina allo 0,5% (v/v). Evitare di avvicinare la tetracaina al naso o alla bocca del topo. Dopo 10 s, tamponare il liquido in eccesso.
      nota: È stato osservato che la dilatazione dell'iride e la visualizzazione della camera anteriore (AC) sono migliorate quando viene somministrata l'anestesia topica, probabilmente a causa di una migliore soppressione del riflesso corneale con l'anestesia sistemica e topica combinata. Tuttavia, questo passaggio può essere omesso se lo si desidera.
   5. Dilatare la pupilla con 1 goccia di fenilefrina al 2,5% (v/v). Prestare attenzione per evitare goccioline in eccesso che potrebbero entrare nel naso o nella bocca. Dopo 2-3 minuti, tamponare il liquido in eccesso.
   6. Per ridurre il rischio di endoftalmite, aggiungere 1 goccia di betadina al 5% sulla superficie dell'occhio e sui capelli circostanti. Lasciare in posa per 2-3 min.
      nota: Eseguire tutte le procedure descritte in questa sezione in condizioni sterili appropriate per prevenire l'endoftalmite.
   7. Rimuovere la betadina e coprire l'occhio con ipromellosa (0,3%) o gel oculare carbomer 0,2% p/p) per prevenire la secchezza in anestesia. Questo aiuterà anche a prevenire la formazione della cataratta.
2. Impostazione del sistema di microiniezione
   1. Eseguire l'iniezione intravitreale utilizzando una micropompa collegata a un controller per microsiringa e una siringa per iniezione (Figura 1A-C). In alternativa, iniettare con un ago da 33 G collegato a una siringa Hamilton come descritto nel paragrafo 4.4.
   2. Collegare un ago da 34 G al supporto per iniezione per assemblare l'iniettore. Allentare il tappo a vite argentato all'estremità anteriore del supporto per iniezione e far scorrere l'ago nel corpo del supporto circa a metà. Serrare a mano il tappo a vite argentato.
   3. Collegare il tubo al supporto di iniezione come indicato nei passaggi 4.2.4-4.2.5.
   4. Per inserire il tubo sul supporto di iniezione, allentare la vite di plastica sull'estremità posteriore del supporto, far scorrere il tubo attraverso la guarnizione all'interno e serrare la vite.
   5. Mantenere un leggero spazio con l'estremità del tubo per evitare danni al tubo durante l'iniezione. Fare riferimento alla Figura 1C.
   6. Scongelare un'aliquota di 100 μl della sospensione madre di mycobacterium.
   7. Aggiungere 3 μl di una soluzione di fluoresceina sodica all'1% (AK-Fluor) e agitare bene.
   8. Caricare una siringa da 10 μl con la miscela di antigene e fluoresceina senza includere bolle d'aria.
   9. Rimuovere l'ago di caricamento dalla siringa e far scorrere il tubo attraverso la guarnizione argentata del tappo a vite fino a quando la punta raggiunge il segno zero nel corpo della siringa.
   10. Una volta che la punta del tubo è correttamente allineata nella posizione desiderata, serrare a mano il tappo a vite.
   11. Lavare la soluzione nella siringa attraverso il tubo di iniezione per caricare completamente il sistema. Quindi ripetere i passaggi 4.2.8-4.2.11 per ricaricare la siringa iniettabile.
   12. Per installare la siringa caricata sulla micropompa, premere il pulsante di rilascio del morsetto all'estremità della micropompa per aprire i morsetti della siringa.
   13. Posizionare il tappo dello stantuffo nel supporto del tappo dello stantuffo all'estremità posteriore della micropompa.
   14. Quindi far scorrere il collare della siringa sul fermo del collare e il corpo della siringa nel morsetto della siringa.
   15. Rilasciare il pulsante di bloccaggio e serrare la vite di fissaggio dello stantuffo. Fare riferimento alla Figura 1D.
   16. Far scorrere il supporto per l'iniezione e l'ago attraverso l'o-clamp sull'apparecchio per iniezione stereotassica. Si tratta di una piattaforma personalizzata; In alternativa, la siringa può essere tenuta e posizionata manualmente.
   17. Impostare il volume di infusione e la velocità del volume di infusione sul controller della micropompa a siringa per iniettare 500 nL per ciclo a una velocità di 40 nL/s, rispettivamente.
       nota: È possibile utilizzare velocità di iniezione più elevate, tuttavia, è possibile che si verifichi un maggiore reflusso prima di poter ottenere il riposizionamento dell'ago.
   18. Testare il sistema per garantire il corretto funzionamento prima di eseguire un'iniezione intravitreale.
       nota: Quando il sistema di iniezione funziona correttamente, l'attivazione di un ciclo di iniezione utilizzando il pedale o il pad di controllo produrrà un movimento visibile del supporto del cappuccio dello stantuffo e una piccola goccia di liquido verdastro sarà visibile sulla punta dell'ago. Nel caso in cui non venga prodotto liquido, attivare cicli aggiuntivi o sciacquare e ricaricare la siringa.
   19. Prima di iniettare l'occhio, strofinare delicatamente l'ago con un tampone di etanolo al 95%.
3. Procedura di iniezione intravitreale
   1. Il topo viene posizionato su un apparecchio stereotassico per eseguire la procedura di iniezione.
   2. Mantieni caldo il palco/piattaforma su cui poggia il mouse attaccando 2-3 tovaglioli di carta sulla sua superficie.
   3. Posizionare il mouse in posizione prona sulla piattaforma. Usa le barre auricolari destra e sinistra per fissare delicatamente la testa dell'animale. Fare riferimento alla Figura 1E.
   4. Posizionare il mouse e orientarlo sotto il cannocchiale in modo che sia visibile l'aspetto nasale superiore dell'occhio destro.
   5. Usa un ago da 30 G per spostare le ciglia ed esporre la sclera. Visualizza il limbus e il vaso sanguigno radiale.
   6. Utilizzare un ago sterile da 30 G per praticare un foro guida nella sclera 1-2 mm posteriormente al limbus.
   7. Inserire l'ago da 34 G attaccato al supporto per iniezione nell'occhiello attraverso il foro guida con un angolo che eviti la lente, ma posizionare la punta dell'ago nella cavità vitreale.
   8. Utilizzando il controller della micropompa a siringa, iniettare con cautela 1 μL di estratto di Mtb nella cavità vitreale. In caso di reflusso costante, aumentare il volume di iniezione a 1,5 μL per garantire un'adeguata erogazione della dose.
      nota: Per i controlli fittizi, iniettare 1 μL di PBS nell'occhio dell'animale.
   9. Verificare il posizionamento intravitreale mediante la visualizzazione di un riflesso verdastro nell'occhio. Fare riferimento alla Figura 1F.
   10. Dopo 10 s, estrarre l'ago dalla cruna Notare eventuali reflusso.
   11. Rimuovi il mouse dalla piattaforma, posiziona lo 0,3% di ipromellosa o lo 0,2% p/p di unguento per gli occhi carbomer su entrambi gli occhi per la protezione della cornea e spostati nella scatola di riscaldamento per il recupero.
   12. Non lasciare il topo incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Non tornare in compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.
   13. Quando il topo è completamente sveglio, torna nella gabbia e aggiungi una bottiglia d'acqua medicata con paracetamolo (200-300 mg/kg/die). Etichettare la scheda della gabbia con la data dell'iniezione IVT.
   14. Le iniezioni intravitreali sono generalmente ben tollerate. I segni clinici che possono indicare dolore e la necessità di rimozione dallo studio includono alopecia perioculare (indicativa di autotrauma), ulcerazione corneale, perdita di peso e postura curva.

Risultati

Figura 1: Configurazione dell'iniezione intravitreale nel topo. L'iniezione intravitreale viene eseguita sull'occhio del topo utilizzando (A) un controller per micropompa a siringa collegato alla (B) Micropompa e (C) una siringa per iniezione. La siringa viene caricata e montata sulla micropompa (D). La testa del mouse viene posizion...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
AK-FLUOR	Akorn Pharmaceuticals, IL, Stati Uniti		10% di fluoresceina sodica 100 mg/mL in flaconcino da 5 mL
AnaSed	Akorn Animal Health, IL, Stati Uniti	NDC 59399-110-20	Xilazina 20 mg/mL
Betadine 5% Soluzione sterile per la preparazione oftalmica	Alcon, Texas, Stati Uniti	8007-1
Aghi di Precisione B-D -25 G	Becton, Dickinson and Company, NJ, Stati Uniti	305122
Ago B-D Precision Glide -30-G	Becton, Dickinson and Company, NJ, Stati Uniti	305106
Legame MAX, Legame Rx	Leica Biosystems, IL, Stati Uniti		Sistema di colorazione IHC automatizzato
Unguento al cloramfenicolo	Martindale Pharma, Romford, Regno Unito		1% p/p di cloramfenicolo
EG1150H	Leica Biosystems, IL, Stati Uniti		Inclusione tissutale
Envisu R2300	Bioptigen/Leica		Macchina OCT
Adiuvante incompleto di Freund	BD Difco, NJ, Stati Uniti	Codice 263910
Unguento per gli occhi lubrificante GenTeal	Alcon, Texas, Stati Uniti	---
Gel contorno occhi lubrificante GenTeal	Alcon, Texas, Stati Uniti	---
Estratto di micobatteri liofilizzati H37Ra	BD Difco, NJ, Stati Uniti	231141
Ago Hamilton RN (33/12/2)S	Hamilton, Reno, NV	7803-05 (33/12/2)	33 g
Siringa di Hamilton	Hamilton, Reno, NV	CAL7633-01	5 μl
Ago per insulina	Exel International, Stati Uniti	Codice 26029	1 ml
Isoflurano
Ketaset	Zoetis, Stati Uniti	377341	Ketamina HCL 100 mg/mL
Pompa a siringa per microiniezione e Micro4Controller	World Precision Instruments, FL, Stati Uniti	UMP3
Micron IV	Laboratori di ricerca Phoenix, Pleasanton, CA		Macchina per imaging/OCT alternativa
Siringa Nanofil da 10 μL	World Precision Instruments, FL, Stati Uniti	NANOFIL
Kit per iniezione intraoculare Nanofil	World Precision Instruments, FL, Stati Uniti	IO-KIT
Olympus SZX10	Olimpo		Ambito di dissezione
Pbs	Gibco	Codice: 14190
Fenilefrina cloridrato soluzione oftalmica USP 2,5% sterile 15 mL	Akorn Pharmaceuticals, IL, Stati Uniti	17478020115
Codice: RM2255	Leica Biosystems, IL, Stati Uniti		Sezionamento tissutale
Siringa TB	Becton, Dickinson and Company, NJ, Stati Uniti	309602	1 ml
Tetracaina 0,5%	Alcon, Texas, Stati Uniti	1041544
Tissue Tek serie VIP	Sakura Finetek Stati Uniti d'America, Inc., CA.		Istologia Processamento tissutale
Tropicamide 1%	Chauvin Pharmaceuticals, Romford, Regno Unito		Minime
Tylenol	Johnson & Johnson Consumer Inc, PA, Stati Uniti	NDC 50580-614-01	Acetaminofene
Viscotears	Novartis Pharmaceuticals, Camberley, Regno Unito		Carbomer gel occhi 0,2% p/p