Preparazione e quantificazione dell'inoculo di Mycobacterium bovis BCG lux per l'infezione

Abstract

Fonte: Asai, M. et al., Uso dell'invertebrato Galleria mellonella come modello di infezione per studiare il complesso Mycobacterium tuberculosis. J. Vis. Exp. (2019)

Questo video dimostra la preparazione e la quantificazione dell'inoculo di Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin lux utilizzando il saggio di bioluminescenza e l'enumerazione delle unità formanti colonie. L'inoculo preparato può essere utilizzato per studi sulle infezioni.

Protocollo

NOTA: Tutto il lavoro descritto di seguito deve essere svolto in un laboratorio CL2 all'interno di una cabina di sicurezza microbiologica (MSC) di classe 2 seguendo le linee guida locali in materia di salute e sicurezza.

1. Preparazione di M. bovis BCG lux per l'infezione

1. Scongelare una scorta congelata di 1,2 mL di glicerolo (15%) di M. bovis BCG lux, il ceppo vaccinale di Montreal trasformato con il plasmide navetta pSMT1 che trasporta i geni luxAB di Vibrio harveyi che codifica per l'enzima luciferasi.
2. Inoculare 15 ml di brodo Middlebrook 7H9 contenente lo 0,2% di glicerolo, il 10% di albumina, destrosio, arricchimento di catalasi (ADC) e 50 μg/mL di igromicina con un'aliquota scongelata da 1,2 ml di BCG lux, in un pallone di Erlenmeyer da 250 ml etichettato.
3. Collocare il matraccio in un contenitore sigillato di biosicurezza e incubare a 37 °C in un incubatore con agitatore orbitale a 220 giri/min per 72 ore (o fino a quando la coltura non raggiunge la fase di crescita a metà logaritmico).
4. Controllare la crescita della coltura di BCG lux preparando diluizioni 1:10 della coltura in provette luminometriche utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, tampone fosfato 0,01 M, cloruro di potassio 0,0027 M e cloruro di sodio 0,137 M) in duplicato. Vortice e caricare i tubi del luminometro nel luminometro e misurare la bioluminescenza (unità di luce relativa [RLU]/mL) utilizzando l'aldeide n-decil come substrato (1% v/v in etanolo assoluto).
   nota: Il rapporto tra RLU/unità formanti colonie (CFU) era stato precedentemente determinato essere 3:1 quando BCG lux è stato coltivato in vitro nel brodo Middlebrook 7H9.
5. Centrifugare la coltura a 2.175 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule e scartare il surnatante in un disinfettante appropriato con attività micobattericida nota. Smaltire tutti i rifiuti di coltura con disinfettanti appropriati per i micobatteri seguendo le linee guida locali.
6. Lavare due volte il pellet cellulare in PBS contenente lo 0,05% di polisorbato 80 (PBS-T) per prevenire la formazione di aggregazioni batteriche.
7. Dopo il lavaggio finale, decantare il surnatante di scarto, risospendere il pellet di cellule micobatteriche in PBS-T e diluire la sospensione micobatterica alla densità cellulare desiderata utilizzando misurazioni RLU.
8. Preparare diluizioni seriali dieci volte dell'inoculo in piastre a 24 pozzetti utilizzando PBS-T. Prelevare 10 μL su piastre di agar Middlebrook 7H11 (0,5% glicerolo, 50 μg/mL di igromicina, 10% acido oleico, albumina, destrosio, catalasi [OADC]) in duplice copia per enumerare la conta delle CFU dell'inoculo.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Provetta di reazione da 1,5 ml (Eppendorf)	Eppendorf	22431021
Pipette da 20, 200 e 1000 μl e puntali filtrati	Qualsiasi fornitore	n/a
Piastra di coltura a 24 pozzetti	Greiner	Codice 662160
Pipette da 25 ml e pipetta ragazzo	Qualsiasi fornitore	n/a
Piastra Petri a 3 scomparti (94/15 mm)	Greiner	637102
centrifuga	Qualsiasi fornitore	n/a
Armadio di sicurezza di classe II	Qualsiasi fornitore	n/a
Etanolo (>99,7%)	VWR	Codice 208221.321
glicerolo	Sigma-Aldrich	G5150
Igromicina B	Corning	30-240CR
Luminometro (Autolumat LB 953)	Berthold	Telefono 34622
Tubi luminometrici	Corning	352054
Microcentrifuga	Qualsiasi fornitore	n/a
Middlebrook 7H11 agar	BD Bioscienze	Codice 283810
Brodo Middlebrook 7H9	BD Bioscienze	Codice 271310
Arricchimento ADC di Middlebrook	BD Bioscienze	212352
Arricchimento OADC di Middlebrook	BD Bioscienze	Codice 212240
Mycobacterium bovis BCG lux	diverso	n/a
aldeide n-decilica	Sigma-Aldrich	D7384-100G
Incubatore con agitazione orbitale	Qualsiasi fornitore	n/a
Soluzione salina tamponata con fosfati	Sigma-Aldrich	P4417-100SCHEDA
Polisorbato 80 (Tween-80)	Sigma-Aldrich	P8074-500 ml
Pallone di Erlenmeyer con tappo ventilato (250 ml)	Corning	CLS40183
Winterm (V1.08)	Berthold	n/a	Programma LB953.TTB