NOTA: Tutto il lavoro descritto di seguito deve essere svolto in un laboratorio CL2 all'interno di una cabina di sicurezza microbiologica (MSC) di classe 2 seguendo le linee guida locali in materia di salute e sicurezza.
1. Preparazione di M. bovis BCG lux per l'infezione
- Scongelare una scorta congelata di glicerolo da 1,2 mL (15%) di Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG) lux, il ceppo vaccinale di Montreal trasformato con il plasmide navetta pSMT1 che trasporta i geni luxAB di Vibrio harveyi che codifica per l'enzima luciferasi.
- Inoculare 15 ml di brodo Middlebrook 7H9 contenente lo 0,2% di glicerolo, il 10% di albumina, destrosio, arricchimento di catalasi (ADC) e 50 μg/mL di igromicina con un'aliquota scongelata da 1,2 ml di BCG lux, in un pallone di Erlenmeyer da 250 ml etichettato.
- Collocare il matraccio in un contenitore sigillato di biosicurezza e incubare a 37 °C in un incubatore con agitatore orbitale a 220 giri/min per 72 ore (o fino a quando la coltura non raggiunge la fase di crescita a metà logaritmico).
- Controllare la crescita della coltura di BCG lux preparando diluizioni 1:10 della coltura in provette luminometriche utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,4, tampone fosfato 0,01 M, cloruro di potassio 0,0027 M e cloruro di sodio 0,137 M) in duplicato. Vortex, e caricare i tubi del luminometro nel luminometro e misurare la bioluminescenza (unità di luce relativa [RLU]/mL) utilizzando l'aldeide n-decilico come substrato (1% v/v in etanolo assoluto).
NOTA: Il rapporto tra RLU/unità formanti colonie (CFU) è stato precedentemente determinato essere 3:1 quando BCG lux è stato coltivato in vitro in brodo Middlebrook 7H9.
- Centrifugare la coltura a 2.175 x g per 10 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule e scartare il surnatante in un disinfettante appropriato con attività micobattericida nota. Smaltire tutti i rifiuti di coltura con disinfettanti appropriati per i micobatteri seguendo le linee guida locali.
- Lavare due volte il pellet cellulare in PBS contenente lo 0,05% di polisorbato 80 (PBS-T) per prevenire la formazione di aggregazioni batteriche.
- Dopo il lavaggio finale, decantare il surnatante di scarto, risospendere il pellet di cellule micobatteriche in PBS-T e diluire la sospensione micobatterica alla densità cellulare desiderata utilizzando misurazioni RLU.
- Preparare diluizioni seriali dieci volte dell'inoculo in piastre a 24 pozzetti utilizzando PBS-T. Prelevare 10 μL su piastre di agar Middlebrook 7H11 (0,5% glicerolo, 50 μg/mL di igromicina, 10% acido oleico, albumina, destrosio, catalasi [OADC]) in duplice copia per enumerare la conta delle CFU dell'inoculo.
2. Preparazione delle larve di G. mellonella
- Acquistare le larve dell'ultimo stadio da fonti appropriate e mantenere le larve al buio a 18 °C all'arrivo e utilizzare entro 1 settimana dall'acquisto. In alternativa, le larve possono essere allevate autonomamente seguendo il protocollo di Jojāo et al. Per le larve acquistate, scartare le larve morte, scolorite o impupate prima della conservazione.
NOTA: Le larve che si impupano sono morfologicamente distinguibili dalle larve dell'ultimo stadio.
- Identificare e selezionare larve sane per la sperimentazione, in base al colore crema uniforme con poca o nessuna decolorazione (melanizzazione), dimensioni (2-3 cm di lunghezza), peso (circa 250 mg), mostrando un alto livello di motilità e possedendo la capacità di raddrizzarsi quando girate.
- Contare attentamente le larve sane (minimo 20-30 per gruppo) in una capsula di Petri (94/15 mm) rivestita con uno strato di carta da filtro (94/15 mm) utilizzando una pinzetta smussata per ridurre al minimo la contaminazione e conservare a temperatura ambiente al buio fino al momento dell'uso.
3. Infettare G. mellonella con BCG lux
- Riduci al minimo l'ingombro all'interno dell'MSC per ridurre il rischio di contaminazione e lesioni da puntura d'ago.
- Preparare la piattaforma di iniezione fissando con nastro adesivo una carta da filtro circolare (94 mm) su una superficie piana rialzata. È possibile utilizzare superfici morbide o dure che dipendono interamente dalle preferenze dell'utente, ad esempio i coperchi delle pipette o una spugna abrasiva in nylon.
- Sterilizzare una microsiringa da 25 μl (25 G) aspirando 3 volumi di etanolo al 70% e risciacquare ulteriormente con 3 volumi di PBS-T sterile.
- Aspirare 10 μL di inoculo di flusso BCG (preparato nella sezione 1) o PBS-T nella microsiringa sterilizzata da 25 μL. Utilizzare una siringa separata per il controllo negativo PBS-T.
NOTA: Risospendere l'inoculo di BCG lux dopo 10 iniezioni per garantire una sospensione cellulare uniforme.
- Usa le pinzette per raccogliere una larva e posizionarla sulla piattaforma di iniezione.
- Sulla piattaforma, capovolgi la larva sulla schiena e immobilizzala fissando la testa e la coda con una pinzetta. Individuare l'ultima proleg sinistra alla rovescia dalla testa della larva e inserire con cautela la punta dell'ago (5-6 mm) con un angolo di 10-20° rispetto al piano orizzontale.
nota: Le pinzette corte e strette consentono una facile immobilizzazione con il minimo stress larvale. Prestare attenzione a non penetrare eccessivamente, il che potrebbe perforare l'intestino e causare melanizzazione o morte non specifica per il flusso BCG.
- Conta le larve infette in una capsula di Petri rivestita con uno strato di carta da filtro, una singola piastra di Petri da 90 mm può ospitare fino a 30 larve.
- Conservare la capsula di Petri contenente le larve in una scatola scura ventilata o non sigillata all'interno di un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2.
4. Monitoraggio della sopravvivenza di G. mellonella dopo l'infezione
- Nel corso del tempo, monitorare la sopravvivenza delle larve ogni 24 ore. Le larve sono considerate morte quando non riescono a muoversi in risposta al tatto.
5. Misurazione del carico in vivo di BCG lux in G. mellonella
- Ad ogni momento, selezionare casualmente cinque larve infette precedentemente preparate nella sezione 3 e sterilizzare delicatamente le superfici larvali utilizzando tamponi di cotone imbevuti di etanolo al 70%.
NOTA: Questo passaggio è importante quando si prepara l'omogenato larvale per l'enumerazione delle CFU micobatteriche, poiché le larve non sterilizzate possono portare alla contaminazione.
- Collocare le larve singolarmente in provette da 2 mL di matrice di lisi contenenti 800 μL di PBS sterile.
- Omogeneizzare le larve utilizzando un omogeneizzatore per 60 s a 6,0 m/s.
- Centrifugare le provette di lisi a 3.500 x g per 5 s per rimuovere l'omogenato dai coperchi e decantare accuratamente l'omogeneizzato in provette luminometriche sterili singolarmente.
nota: Per l'enumerazione delle CFU (passaggio 5.7), assicurarsi di riservare 100 μl di omogenato in una provetta di reazione sterile da 1,5 mL.
- Recuperare l'omogeneizzato rimanente lavando le provette della matrice di lisi con 1 mL di PBS-T e pipettarle nelle provette del luminometro corrispondenti.
- Agitare i tubi del luminometro e misurare la bioluminescenza degli omogeneizzati precedentemente descritti al punto 1.4.
- Preparare diluizioni seriali dieci volte dell'omogenato in piastre di coltura a 24 pozzetti utilizzando PBS-T. Prelevare 10 μL della diluizione su piastre di agar Middlebrook 7H11 contenenti glicerolo allo 0,5%, 50 μg/mL di igromicina, 10% di OADC e 20 μg/mL di piperacillina, per determinare il rapporto RLU/CFU di BCG lux dopo l'infezione in vivo.
NOTA: La piperacillina elimina il microbiota nativo di G. mellonella con un'inibizione minima della crescita di BCG lux.
