Un modello murino Air Pouch per la raccolta dell'essudato infiammatorio indotto da lipopolisaccaridi

In questo articolo

Abstract

Fonte: Lu, Q., et al. Rilevamento della migrazione e dell'infiltrazione di neutrofili nei topi. J. Vis. Exp.(2020).

Questo video descrive la procedura per generare una sacca d'aria nel tessuto sottocutaneo dei topi e raccogliere essudati infiammatori in risposta alla somministrazione di lipopolisaccaridi in vivo. Questo video copre anche l'analisi dell'infiltrazione di neutrofili nella sacca d'aria.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Saggio della sacca d'aria

Prima iniezione d'aria
1. Il giorno 0, anestetizzare completamente i topi con isoflurano al 5% per 3 minuti in una camera di anestesia gassosa a una velocità di 2 L/min e mantenere l'anestesia di ciascun topo in una singola unità di respirazione con isoflurano al 2% a una velocità di 0,5 L/min.
  nota: Una profondità sufficiente dell'anestesia è assicurata pizzicando le dita dei piedi prima di spostare i topi dalla camera alla singola unità di respirazione. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei piedi sono pizzicate.
2. Utilizzare un filtro da 0,22 μm collegato a una siringa da 5 ml per ottenere un volume di 3 ml di aria sterilizzata.
3. Sollevare la pelle posteriore del topo anestetizzato con una pinzetta e iniettare per via sottocutanea 3 ml di aria sterilizzata utilizzando un ago da 26 G x 3/8".
4. Dopo il trattamento, rimuovere i topi dall'unità di respirazione. Monitora i topi per assicurarti che siano vivi fino a quando non iniziano a muoversi.
Seconda iniezione d'aria
1. Il giorno 3, iniettare altri 3 ml di aria sterilizzata nella sacca d'aria precedentemente stabilita per sostenere la sacca d'aria come descritto nel paragrafo 1.1.
trattamento
1. Il giorno 6, 6 ore prima del sacrificio, iniettare diversi trattamenti nella sacca d'aria. Iniettare 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) come controllo negativo. Iniettare 1 mL di 1 μg/mL di LPS come controllo positivo per indurre l'infiammazione locale.
2. Anestetizzare completamente i topi con isoflurano al 5% per 3 minuti in una camera di anestesia gassosa a una velocità di 2 L/min e mantenere l'anestesia di ciascun topo in una singola unità di respirazione con isoflurano al 2% a una velocità di 0,5 L/min. Preparare il tampone di lavaggio secondo la Tabella dei materiali.
  nota: Una profondità sufficiente dell'anestesia è assicurata pizzicando le dita dei piedi prima di spostare i topi dalla camera alla singola unità di respirazione. Le gambe non devono muoversi quando le dita dei piedi sono pizzicate.
3. Per ogni sacca d'aria, lavare la sacca d'aria con 1 mL di tampone di lavaggio e raccogliere l'essudato infiammatorio in una provetta da centrifuga da 15 mL. Lavare la sacca d'aria con 2 mL di tampone di lavaggio 2 volte e raccogliere l'essudato infiammatorio nella stessa provetta da centrifuga.
4. Centrifugare a 100 x g per 10 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di tampone di lavaggio. Contare le cellule per quantificare il rapporto dei neutrofili utilizzando l'analizzatore ematologico automatico.
  nota: Vedere i risultati rappresentativi nella Figura 1.

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Risultati

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Figura 1: Risultati rappresentativi del test della sacca d'aria. (A) Illustrazione del test della sacca d'aria. (B) Risultati rappresentativi dell'infiltrazione di sottogruppi di leucociti nel test della sacca d'aria. PBS: controllo; LPS: 1 µg/mL LPS. I dati sono presentati come media ± SD.