Quantificazione del carico di Helicobacter pylori nello stomaco di un topo infetto

Abstract

Fonte: D'Costa, K. et al., Modelli murini di infezione da Helicobacter e patologie gastriche. J. Vis. Exp. (2018)

In questo video, descriviamo un protocollo per quantificare il carico di Helicobacter pylori nei tessuti dello stomaco del topo dopo l'infezione per confermarne la colonizzazione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Conferma della colonizzazione batterica nello stomaco dopo l'infezione

1. Conteggio vitale di H. pylori nello stomaco
   1. Integrare le piastre sterili HBA con antibiotici aggiuntivi (200 μg/mL di bacitracina e 10 μg/mL di acido nalidixico) prima di eseguire la conta delle colonie dallo stomaco di topo infetto.
   2. Omogeneizzare le sezioni dello stomaco manualmente, utilizzando micro pestelli in polipropilene autoclavabili o utilizzando uno strumento di dissociazione meccanica (vedi Tabella dei materiali).
   3. Preparare diluizioni seriali duplicate (da ^10-1 a ^10-2) degli omogeneizzati gastrici risultanti in BHI.
      sterile nota: Le diluizioni devono essere decise in base alle cariche batteriche tipiche ottenute per un dato ceppo di H. pylori utilizzato per l'infezione, nonché alla durata dell'infezione. Possono essere utilizzati anche campioni non diluiti.
   4. Dividere le piastre HBA pre-essiccate (NOTA: per garantire l'isolamento delle singole colonie, le piastre HBA devono essere riscaldate e asciugate in una cabina di sicurezza biologica o in un'incubatrice a 37 °C per 10-15 minuti prima dell'uso) in tre o quattro segmenti. Utilizzando un adattamento della tecnica di Miles e Misra, aggiungere 10-100 ml di ciascuna diluizione su un segmento della piastra di agar e distribuire utilizzando anse di plastica sterili.
   5. Lasciare asciugare le piastre e poi metterle in posizione capovolta (con il coperchio rivolto verso il basso) in barattoli di gas anaerobi. Per mantenere l'umidità nei barattoli, includi una capsula di Petri contenente acqua.
   6. Incubare i barattoli a 37 °C fino alla formazione delle colonie (in genere 4-7 giorni).
   7. Enumerare i segmenti contenenti tra 10 e 100 colonie isolate.
      NOTA: Le colonie di H. pylori e la crescita di H. felis su piastre possono essere distinte da quelle di altri membri del microbiota gastrico murino utilizzando test standard di ureasi, catalasi e ossidasi. H. pylori e H. felis sono positivi a tutti e tre i test.
   8. Calcolare le cariche batteriche come (UFC/g di tessuto), utilizzando la seguente formula:
      [(Numero medio di colonie contate) × (fattore di diluizione) x (volume piastrato)]/(peso dello stomaco).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagenti batteriologici
Oxoid Blood Agar Base No.2	Thermo Fischer Scientific	CM0271B	Sciogliere in acqua deinonizzata prima della sterilizzazione
Sangue di cavallo defibrinato premium	Biologici etici australiani	PDHB100
Bacto Brain Brodo per infusione di cuore	BD Bioscienze	Codice 237500	Sciogliere in acqua deinonizzata prima della sterilizzazione
Pacchetti di gas CampyGen	Thermo Fischer Scientific	CN0035A/CN0025A
antibiotici
Vancomycin	Sigma Aldrich	V2002-1G	Sciogliere in acqua deionizzata
Polimixina B	Sigma Aldrich	P4932-5MU	Sciogliere in acqua deionizzata
Trimetoprim (≥98% HPLC)	Sigma Aldrich	T7883	Sciogliere in etanolo (assoluto) al 100%
amfotericina	Amresco (Astral Scientific)	E437-100MG	Sciogliere in acqua deionizzata
Bacitracina da Bacillus licheniformis	Sigma Aldrich	B0125	Sciogliere in acqua deionizzata
Acido naladissico	Sigma Aldrich	N8878	Sciogliere in acqua deionizzata
Attrezzature e articoli in plastica
Barattoli anaerobici Oxoid	Thermo Fischer Scientific	HP0011/HP0031
Pipette COPAN Pasteur	Servizi Interpath	200CS01
Eppendorf 5810R centrifuga			Raccogliere i pellet batterici mediante centrifugazione a 2.200 giri/min per 10 minuti a 4°C
Parafilm M	Bemis, VWR	PM996
Micropestello Eppendorf per provette da 1,2 - 2 mL	Sigma Aldrich	Z317314	Pestelli in polipropilene autoclavabili utilizzati per l'omogeneizzazione dello stomaco
Dissociatore GentleMACs	Miltenyi Biotec	130-093-235	Utilizzare un programma gentleMACS preimpostato per il tessuto dello stomaco del topo
Tubi M (tappo arancione)	Miltenyi Biotec	30-093-236
Fluorimetro Qubit	Thermo Fischer Scientific	Domanda 33216
Ansa in plastica sterile	Serv di laboratorio	LBSLP7202