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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei cateteri
- Preparare una cannula pediatrica per l'accesso endovenoso per ogni gruppo di topi da infettare. Utilizzando il meccanismo a molla integrato, spogliare ogni cannula del suo ago, come indicato dal produttore. Scartare gli aghi, conservando solo la cannula endovenosa in plastica.
- Sterilizzare i cateteri in una cappa a flusso laminare per un ciclo a raggi ultravioletti (U.V.), in genere 25 - 30 min.
Nota: i cateteri possono essere utilizzati per più di un topo, tuttavia, un nuovo catetere dovrebbe essere utilizzato tra gruppi sperimentali, sessi o ceppi batterici.
2. Preparazione di E. coli uropatogeno per l'infezione
- Almeno due giorni prima dell'infezione, utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, striare l'UPEC da un ceppo batterico congelato su una piastra di agar Luria Broth (LB), contenente antibiotici se appropriato. Incubare a 37 °C per una notte. Le piastre possono essere conservate a 4 °C per un massimo di una settimana.
- In un matraccio sterile di Erlenmeyer da 100 ml, inoculare 10 ml di LB, eventualmente contenenti antibiotici, con una singola colonia dalla piastra LB e incubare a 37 °C durante la notte (circa 16 - 18 ore).
Nota: Le colture in piedi consentono l'espressione di pili di tipo 1, necessari per l'infezione. Le colture coltivate agitando avranno un'espressione di pili meno efficiente e, quindi, tassi di infezione incoerenti.
- Misurare la densità ottica (OD)600 della coltura notturna e calcolare il numero di batteri per ml utilizzando una curva di crescita predeterminata. Ad esempio, per il ceppo UPEC UTI89, OD600 = 0,35 equivale a 2 x 108 CFU per ml, quindi, una coltura notturna con OD600 = 2,4 equivarrebbe a 13,7 x 108 CFU per ml. Determinare empiricamente la relazione tra l'OD600 e i batteri vitali con ogni nuovo ceppo impiegato per l'infezione.
- Determinare la quantità di batteri necessari considerando il numero di animali da infettare e che ogni topo dovrebbe ricevere circa 10-7 unità formanti colonie (CFU) in 50 μl di PBS. Includere nel calcolo il volume morto di ~130 μl del catetere e della protuberanza della siringa e i 100 μl necessari per determinare l'inoculo.
- Centrifugare la sospensione batterica in una microcentrifuga da tavolo a 17.000 x g per 1 minuto e risospendere il pellet batterico risultante a 2 x 108 CFU per ml in PBS. Diluire in serie un'aliquota di questa sospensione e impiattarla su agar LB, con antibiotici se appropriato, per determinare l'inoculo esatto per ogni infezione.
- Aspirare l'inoculo batterico in una siringa da 1 ml e collegare il catetere all'estremità della siringa. Picchiettare la siringa per rimuovere l'aria e premere lo stantuffo per riempire lo spazio d'aria morta nel catetere prima di iniziare l'instillazione.
3. Preparazione dei topi
- Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina. Può essere fornito calore supplementare.
- Assicurarsi che ogni mouse sia completamente sedato premendo il poggiapiedi con una pressione media. I topi sono completamente sedati quando non reagiscono e impiegano 3-5 minuti per raggiungere questo stato.
- Posizionare i topi in posizione supina e applicare una pressione media sul basso addome per svuotare la vescica dall'urina. Le vesciche piene si sentono come un pisello sotto la pelle tra le creste iliache.
Nota: l'isoflurano per via inalatoria è stato utilizzato per cateterizzare topi femmine, tuttavia, non è stato testato se i topi maschi siano sufficientemente anestetizzati dall'isoflurano per via inalatoria per questa procedura.
4. Instillazione transuretrale di topi maschi
- Posizionare due pinze per il pollice cranialmente e caudalmente ai genitali esterni del topo. Ritrarre il prepuzio per esporre completamente il glande. Una volta posizionato esternamente il pene, rilasciare la pinza per il pollice.
- Riposizionare la pinza per stabilizzare il pene sporgente perpendicolarmente all'animale, tenendo l'organo delicatamente ma teso. Visualizza il meato uretrale e introduci con attenzione il catetere nella piccola apertura sulla punta dell'organo. Guidare delicatamente il catetere nel pene, verso il corpo del topo, mantenendo una leggera tensione con la pinza. Il catetere non richiede lubrificazione. Non forzare il catetere nel pene; Il catetere deve scorrere dolcemente nell'uretra, indicando il corretto posizionamento.
- Una volta che il mozzo del catetere incontra la punta del pene, erogare molto lentamente 50 μl di inoculo, mantenendo la posizione del pene. La qualità dell'instillazione può essere notata in questo momento in base a un punteggio di qualità dell'instillazione predeterminato, come quello mostrato nella Figura 1.
- Ritrarre il catetere lentamente, contando fino a 5, per evitare la fuoriuscita dell'inoculo. Metti i topi nelle loro gabbie in posizione supina. Gli animali dovrebbero iniziare a riprendersi 30-45 minuti dopo la somministrazione dell'anestetico.
