Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dei cateteri
- Preparare una cannula pediatrica per l'accesso endovenoso per ogni gruppo di topi da infettare. Utilizzando il meccanismo a molla integrato, spogliare ogni cannula del suo ago, come indicato dal produttore. Scartare gli aghi, conservando solo la cannula endovenosa in plastica.
- Sterilizzare i cateteri in una cappa a flusso laminare per un ciclo a raggi ultravioletti (U.V.), in genere 25 - 30 min.
nota: I cateteri possono essere utilizzati per più di un topo, tuttavia, un nuovo catetere dovrebbe essere utilizzato tra gruppi sperimentali, sessi o ceppi batterici.
2. Preparazione di Escherichia coli uropatogeno per l'infezione
- Almeno due giorni prima dell'infezione, utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, striare l'Escherichia coli uropatogeno (UPEC) da un ceppo batterico congelato su una piastra di agar Luria Broth (LB), contenente antibiotici se appropriato. Incubare a 37 °C per una notte. Le piastre possono essere conservate a 4 °C per un massimo di una settimana.
- In un matraccio sterile di Erlenmeyer da 100 ml, inoculare 10 ml di LB, eventualmente contenenti antibiotici, con una singola colonia dalla piastra LB e incubare a 37 °C durante la notte (circa 16 - 18 ore).
nota: Le colture in piedi consentono l'espressione dei pili di tipo 1, necessari per l'infezione. Le colture coltivate agitando avranno un'espressione di pili meno efficiente e, quindi, tassi di infezione incoerenti.
- Misurare la densità ottica (OD)600 della coltura notturna e calcolare il numero di batteri per ml utilizzando una curva di crescita predeterminata. Ad esempio, per il ceppo UPEC UTI89, OD600 = 0,35 equivale a 2 x 108 unità formanti colonie (CFU) per ml, quindi, una coltura notturna con un OD600 = 2,4 equivarrebbe a 13,7 x 108 CFU per ml. Determinare empiricamente la relazione tra l'OD600 e i batteri vitali con ogni nuovo ceppo impiegato per l'infezione.
- Determinare il numero di batteri necessari considerando il numero di animali da infettare e che ogni topo dovrebbe ricevere circa 10-7 unità formanti colonie (CFU) in 50 μl di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Includere nel calcolo il volume morto di ~130 μl del catetere e della protuberanza della siringa e i 100 μl necessari per determinare l'inoculo.
- Centrifugare la sospensione batterica in una microcentrifuga da tavolo a 17.000 x g per 1 minuto e risospendere il pellet batterico risultante a 2 x 108 CFU per ml in PBS. Diluire in serie un'aliquota di questa sospensione e impiattarla su agar LB, con antibiotici se appropriato, per determinare l'inoculo esatto per ogni infezione.
- Aspirare l'inoculo batterico in una siringa da 1 ml e collegare il catetere all'estremità della siringa. Picchiettare la siringa per rimuovere l'aria e premere lo stantuffo per riempire lo spazio d'aria morta nel catetere prima di iniziare l'instillazione.
3. Preparazione dei topi
- Anestetizzare i topi mediante iniezione intraperitoneale di 100 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina. Può essere fornito calore supplementare.
- Assicurarsi che ogni mouse sia completamente sedato premendo il poggiapiedi con una pressione media. I topi sono completamente sedati quando non reagiscono e impiegano 3-5 minuti per raggiungere questo stato.
- Posizionare i topi in posizione supina e applicare una pressione media sul basso addome per svuotare la vescica dall'urina. Le vesciche piene si sentono come un pisello sotto la pelle tra le creste iliache.
nota: L'isoflurano per via inalatoria è stato utilizzato per cateterizzare topi femmine, tuttavia, non è stato testato se i topi maschi siano sufficientemente anestetizzati dall'isoflurano per via inalatoria per questa procedura.
4. Instillazione transuretrale di topi femmina
- Usando la mano non dominante, posiziona il pollice sulla coda e un dito della stessa mano sull'addome del topo e applica una leggera pressione in direzioni opposte per tenere il mouse saldamente in posizione.
- Posizionare la punta del catetere perpendicolarmente al topo in corrispondenza dell'orifizio uretrale. Con una leggera pressione, far scorrere il catetere nell'uretra, fino a quando il mozzo incontra l'orifizio uretrale, abbassando contemporaneamente la siringa in modo che sia parallela alla superficie di lavoro. Il catetere non richiede lubrificazione. Non spingere o forzare il catetere nell'uretra. Il catetere dovrebbe scivolare agevolmente e facilmente nell'uretra, con poca o nessuna resistenza.
- Prima di instillare l'inoculo (passaggio 4.3), una volta posizionato il catetere, tirare molto delicatamente la pelle addominale verso la testa del topo con il dito dalla mano non dominante che si trova già sull'addome del topo (passaggio 4.1). Se il catetere si trova nell'uretra, il tessuto che compone l'orifizio dell'uretra non si muoverà, mentre se il catetere è posizionato in modo errato nella vagina, il tessuto si sposterà verso l'alto e lontano dal catetere. Questo test rapido deve essere eseguito su ciascun topo.
- Quando il mozzo del catetere incontra l'orifizio uretrale, erogare lentamente 50 μl di inoculo batterico. Una velocità di instillazione lenta riduce al minimo il reflusso vescico-ureterale nel rene. Rimuovere lentamente il catetere per evitare perdite, contando fino a 5. Metti i topi nelle loro gabbie in posizione supina.
