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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Analisi citofluorimetrica del tessuto vescicale
- Preparare un tampone di digestione contenente collagenasi a 34 unità/mL e DNasi a 100 μg/mL, in PBS. Mantenere il ghiaccio. Preparare una provetta conica da 15 ml per ogni animale da analizzare e aliquotare 1 ml di tampone di digestione per provetta.
- In momenti predeterminati, sacrificare i topi utilizzando procedure operative standard approvate (ad esempio, lussazione cervicale o sovradosaggio di anidride carbonica). Inumidire accuratamente l'addome con etanolo al 70% per ridurre al minimo la contaminazione da pelo.
- Praticare un'incisione sul terzo inferiore dell'addome del topo di almeno 2 cm con le forbici e rimuovere l'intera vescica. Tritare bene con le forbici, tagliando la vescica in 2 - 3 mm di2 pezzi, in genere circa 8 pezzi.
- Aggiungere una vescica tritata per ogni provetta contenente il tampone di digestione. Agitare per lavare il tessuto vescicale tritato nel tampone digestivo. Tenere in ghiaccio fino a quando tutte le vesciche non sono state sezionate e tritate.
- Incubare le vesciche tritate per 60 - 75 minuti a 37 °C, agitando energicamente a mano per 5 s ogni 15 min. Quando il fazzoletto ha un aspetto vetroso trasparente, simile alla carta velina bagnata, la digestione è completa. La digestione prolungata rimuoverà le proteine di superficie dalle cellule necessarie per l'identificazione e dovrebbe essere evitata.
- Inattivare gli enzimi della digestione aggiungendo 2 - 3 mL di tampone per citometria a flusso ghiacciato (PBS contenente il 2% di siero fetale bovino (FBS) e 0,2 mM EDTA) e mescolare delicatamente. Posizionare i tubi sul ghiaccio.
- Per garantire una sospensione unicellulare e rimuovere l'eventuale tessuto connettivo, far passare il contenuto della provetta attraverso un filtro da 100 μm posto in una provetta conica da 15 mL. Premere delicatamente il tessuto rimanente attraverso il filtro con l'estremità di uno stantuffo della siringa. Lavare il filtro con un ulteriore tampone per citometria a flusso da 2 mL. Conservare i campioni sul ghiaccio.
- Lavare i campioni mediante centrifugazione per 7 minuti a 200 x g, 4 °C. Risospendere i pellet in un tampone per citometria a flusso da 100 μL contenente blocco Fc, diluito a 5 μg/mL, e trasferirli in una piastra di fondo rotonda a 96 pozzetti. Dopo 10-15 minuti, aggiungere 100 μl del cocktail di anticorpi desiderati a ciascun campione. Incubare i campioni per 30 - 45 minuti, su ghiaccio, al riparo dalla luce.
nota: Il blocco Fc è un reagente utilizzato per prevenire il legame della porzione Fc degli anticorpi alle cellule che esprimono i recettori Fc. Il suo scopo è quello di ridurre al minimo il legame con gli anticorpi aspecifici. La determinazione degli anticorpi da utilizzare dipenderà dall'ipotesi testata nell'esperimento e dovrebbe essere selezionata con il contributo della letteratura. Nella Figura 1, per misurare l'infiltrazione complessiva delle cellule immunitarie, è stato impiegato un anticorpo anti-CD45, che è una proteina delle cellule panimmunitarie.
- Lavare i campioni mediante centrifugazione per 7 minuti a 200 x g, 4 °C. Risospendere i pellet cellulari in un tampone per citometria a flusso da 200 μl e far passare i campioni attraverso un filtro cellulare da 40 μm su una provetta di polistirene da 5 ml appena prima dell'acquisizione su un citometro a flusso.
- Raccogliere l'intero campione sul citometro a flusso. Una buona digestione produrrà 200.000 - 400.000 cellule, con 8.000 - 10.000 cellule immunitarie CD45+ provenienti da vesciche di topo naïve, mentre gli organi infetti conterranno più cellule (Figura 1).
nota: I campioni preparati per l'analisi citofluorimetrica non possono essere utilizzati per valutare le CFU. Non è consigliabile dividere la vescica in due parti poiché non esistono prove che dimostrino che la colonizzazione uropatogena di E. coli (UPEC) o l'infiltrazione di cellule immunitarie sia uniforme in tutto il tessuto.
