Una tecnica per stabilire un modello di infezione batterica in una coltura d'organo ex vivo

Abstract

Fonte: Rizzuto, G. A., et al. Colture di organi placentari e deciduali umani per studiare le infezioni all'interfaccia materno-fetale. J. Vis. Exp. (2016)

Questo video mostra un metodo per stabilire un modello di infezione nei tessuti placentari per studiare la propagazione dell'infezione. Una coltura di organi placentari ex vivo è infettata da Listeria monocytogenes, un parassita intracellulare facoltativo. I batteri invadono i trofoblasti extravillosi (EVT) per entrare nel tessuto placentare e quindi propagarsi ad altre cellule attraverso la diffusione da cellula a cellula.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Preparazione delle piastre per colture organistiche

NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti utilizzando una tecnica sterile in una cappa per coltura tissutale. È ideale per il microscopio da dissezione da posizionare in un campo sterile. Tuttavia, ciò non è assolutamente necessario, a condizione che la microdissezione venga eseguita rapidamente e che gli strumenti vengano immersi frequentemente in etanolo al 70%.

1. Scongelare le fiale di matrice extracellulare (ECM) su ghiaccio. Diluire l'ECM 1:1 con un terreno di raccolta ghiacciato e miscelare mediante pipettaggio. Pipettare lentamente per evitare l'introduzione di bolle. Ogni pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti richiede 100 μl di questa sospensione e può ospitare 3-4 colture di organi.
2. Posizionare gli inserti transwell (dimensione dei pori 0,4 μM) in ciascun pozzetto della piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti.
3. Rivestire ciascun inserto transwell con uno strato sottile (100 μl) di sospensione ECM/terreno.
4. Posizionare la piastra sul ghiaccio e procedere immediatamente all'istituzione delle colture di organi. In alternativa, preparare la piastra prima della raccolta dei tessuti, nel qual caso avvolgerla in para-film e conservarla a 4 °C per un uso successivo. Si sconsiglia una conservazione superiore a 6 ore poiché l'ECM si asciugherà.

2. Istituzione di colture organistiche

NOTA: Questo passaggio descrive come posizionare le colture di organi deciduali e le colture di organi villosi in pozzetti separati. I tessuti non sono a contatto. I ricercatori interessati a una tecnica di co-coltura in cui decidua e villi sono in contatto diretto tra loro possono fare riferimento alla letteratura precedente.

1. Sciacquare i campioni due volte nei terreni di raccolta e centrifugare a 1.000 x g tra un risciacquo e l'altro. Trasferire il tessuto in una capsula di Petri sterile e posizionarlo sul tavolino di un microscopio da dissezione. Tenere una piastra a 6 pozzetti sul ghiaccio adiacente al microscopio.
2. Micro-dissezionare il tessuto con forbici da dissezione e pinze sterili springer, per stabilire colture di organi villosi da 2-3 mm (Figura 1A).
   nota: Le colture di organi villosi sono piccoli "alberi" ben vascolarizzati con 2 o 3 rami e con colonne cellulari prominenti di trofoblasto extravilloso (EVT). È importante utilizzare solo tessuto villoso proveniente da campioni di <9 settimane del primo trimestre, poiché l'invasione di trofoblasti extravillosi nella ECM è più pronunciata in queste giovani età.
3. Selezionare villi ben vascolarizzati con colonne cellulari EVT prominenti. Le colonne di celle EVT sono visualizzate come estremità bulbose, "sfocate", "soffici" (fare riferimento alle punte di freccia nella Figura 1A).
4. Utilizzare una pinza sterile per trasferire 3 o 4 alberi villosi in ogni pozzetto. Regola i rami in modo che l'albero sia posizionato in piano sopra l'ECM e separa i rami raggruppati.
5. Micro-dissezionare il tessuto deciduale con forbici da dissezione e pinze sterili springer, per stabilire colture di organi deciduali da 3 mm (Figura 1A).
   nota: I campioni contengono due tipi distinti di tessuti deciduali, decidua parietalis e decidua capsularis (frammenti di tessuto sinistro e destro, rispettivamente, Figura 1A).
6. Rifilare con le forbici per creare^{3 mm 3} pezzi di decidua parietalis. La decidua capsularis non viene utilizzata per queste colture. Usa il forcipe per estrarre il sangue materno coagulato.
7. Utilizzare una pinza sterile per trasferire 3-4 pezzi di decidua in ciascun pozzetto.
8. Aggiungere 1 ml di terreno di raccolta sul fondo del pozzetto. Incubare la piastra per una notte a 37 °C in CO₂ al 5%.
9. Per gli esperimenti in cui è importante imitare la normale tensione di ossigeno placentare del primo trimestre, mantenere le colture di organi villosi in ipossia relativa (3% O₂).
   nota: Le opzioni di laboratorio includono piccole camere per incubatori a ipossia che si inseriscono all'interno di incubatori esistenti o un incubatore a tre gas che introduce gas N₂ esterno per ridurre la concentrazione di ossigeno.
10. Aggiungere 1 ml di terreno villoso o deciduale (Tabella 1) sulla parte superiore del pozzetto dopo 12-16 ore di coltura.
    nota: L'assenza di terreni durante la prima notte in coltura consente alle colonne cellulari del trofoblasto extravilloso di invadere (coltura villosa) e al tessuto (sia villoso che deciduale) di essere saldamente incorporato nella MEC. Nella nostra esperienza, le colture di organi deciduali rimangono vitali per 72 ore e le colture di organi villosi per 96 ore. Si raccomandano endpoint sperimentali che rientrano in questo lasso di tempo. Vedere la Tabella 1 per la composizione del terreno villoso e deciduale. Il terreno villoso ha un'alta percentuale di FBS, mentre il terreno deciduale è integrato con ormoni della gravidanza (progesterone, 17β-estradiolo) che mantengono lo stato decidualizzato (Tabella 1).

3. Preparazione delle colture di L. monocytogenes

NOTA: Per un protocollo dettagliato sulla conservazione a lungo termine di L. monocytogenes, e la coltura e la crescita di questo organismo nel brodo e nell'agar per infusione di cuore cerebrale (BHI), si prega di fare riferimento a Wang et al.

1. Prelevare una singola colonia di L. monocytogenes da una piastra di agar BHI striata e inoculare 3 ml di brodo BHI.
2. Incubare la coltura di L. monocytogenes per una notte (16 ore), in posizione obliqua, a 30 °C.
   nota: Queste condizioni di coltura consentono alla crescita batterica di raggiungere la fase stazionaria. L. monocytogenes viene flagellato a 30 °C, aumentando l'invasione della cellula ospite.

4. Infezione di colture di organi con L. monocytogenes

1. Soluzione salina calda tamponata con fosfato (PBS) e mezzo villoso o deciduale (Tabella 1) a 37 °C.
2. Utilizzare pinzette sterili per rimuovere eventuali pezzi di coltura d'organo che non hanno invaso la MEC e quindi galleggiano nel pozzetto.
3. Aspirare con cura il fluido dal fondo del pozzetto. Sciacquare due volte i pozzetti superiore e inferiore pipettando delicatamente 1 ml di PBS caldo nel pozzetto e aspirando accuratamente tra un pozzetto e l'altro. Pipettare delicatamente 1 ml di terreno villoso o deciduale privo di antibiotici nel pozzetto superiore e inferiore. Fare attenzione a non disturbare la coltura dell'organo.
4. Lasciare incubare il tessuto in terreni privi di antibiotici per almeno un'ora per assicurarsi che gli antibiotici siano stati rimossi.
   nota: Nella fase stazionaria, la densità della coltura di L. monocytogenes è di circa 1 x 10⁹ unità formanti colonie (CFU) per ml. Il numero di batteri utilizzati per infettare le colture di organi dovrebbe essere determinato empiricamente per soddisfare le esigenze sperimentali.
5. Per le infezioni di routine da L. monocytogenes wild-type, gli esperimenti mostrano una robusta invasione con una diluizione di 1:50 durante la notte (4 x 10,⁷ L. monocytogenes in 1 ml di terreno per pozzetto). Risospendere il numero appropriato di batteri in un mezzo villoso o deciduale privo di antibiotici.
6. Aspirare il fluido dalla parte superiore dei pozzetti. Aggiungere delicatamente 1 ml di inoculo. Incubare le piastre a 37 °C in CO₂ al 5% per consentire l'invasione batterica.
7. Rimuovere i batteri extracellulari aspirando i terreni dai pozzetti superiori e inferiori. Sciacquare i pozzetti due volte con PBS caldo. Aggiungere 1 ml di terreno villoso o deciduale integrato con 50 μg di ^ml-1 di gentamicina. Incubare le piastre a 37 °C in CO₂,< /> NOTA: L. monocytogenes è un batterio intracellulare facoltativo che può crescere in un mezzo extracellulare, crescere all'interno delle cellule e diffondersi da una cellula all'altra senza accedere allo spazio extracellulare. La gentamicina ha un effetto battericida su L. monocytogenes extracellulare e quindi consente la misurazione della crescita e della diffusione intracellulare di L. monocytogenes attraverso la coltura d'organo.
   nota: L'infezione riproducibile da L. monocytogenes di colture di organi villosi e decidua si verifica con tempi di incubazione di 5 ore. Il tempo di incubazione prima dell'aggiunta di gentamicina può essere modificato in base alle esigenze sperimentali e alla capacità dell'organismo di invadere il tessuto. Per comprendere meglio i siti anatomici più vulnerabili alle infezioni, si possono utilizzare tempi di incubazione più brevi.
8. Mantenere le piastre a 37 °C in CO₂ al 5% per tutta la durata dell'esperimento. Cambia l'intero supporto in ogni pozzetto ogni giorno.
   nota: Nella nostra esperienza, le colture di organi deciduali infettate da L. monocytogenes rimangono vitali per 48 ore e le colture di organi villosi per 72 ore.

Tabella 1: Ricette multimediali. Componenti e concentrazioni per la preparazione di tampone di lavaggio, terreno di raccolta, terreno villoso e terreno deciduale

Tampone di lavaggio	Mezzo di raccolta	Mezzo villoso	Medio-deciduale
Pbs	DMEM/F-12 con GlutaMAX	DMEM/F-12 con GlutaMAX	DMEM/F-12 con GlutaMAX
Penicillina 100 UI/ml	Siero fetale bovino 2,5%	Siero fetale bovino 20%	Siero fetale bovino 2,5%
Streptomicina 100 μg/ml	Penicillina 100 UI/ml	Penicillina 100 UI/ml	17β-estradiolo 300 pg/ml
Gentamicina 50 μg/ml	Streptomicina 100 μg/ml	Streptomicina 100 μg/ml	Progesterone 20 ng/ml
Amfotericina B 1,25 μg/ml	Gentamicina 50 μg/ml
	Amfotericina B 1,25 μg/ml

Risultati

Figura 1: Colture di organi villosi – Immagini macroscopiche e microscopiche rappresentative.

(A) Due alberi villosi terminali con un'età gestazionale di 6 settimane, osservati al microscopio da dissezione. Si notino le estremità "soffici" (punte di freccia) e la vascolarizzazione fetale prominente che scorre tra i rami dell'albero a sinis...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buste per sterilizzazione	Fisher Scientifico	01-812-54	Per la sterilizzazione in autoclave di singoli strumenti di dissezione
Filtro a maglia fine	Cuisinart (Amazon.com)	Na	Avvolgere completamente in un foglio di alluminio e in autoclave prima della raccolta dei tessuti.
Damigiana con rubinetto	Fisher Scientifico	03-007-647	Per la preparazione di grandi volumi di tampone di lavaggio.
Impacchi di ghiaccio	Laboratori Nortech	GB8818	Questi non devono essere acquistati, ma possono essere riciclati/riutilizzati da qualsiasi spedizione di laboratorio di routine che li includa nell'imballaggio.
70% Etanolo	VWR	V1001	Soluzione al 70% ottenuta aggiungendo dH20 a 190 o 200 alcol di grado di ricerca.
10% candeggina	Fornitura sanitaria Waxie	CLO 30966	Soluzione al 10% ottenuta con l'aggiunta di dH20.
Scatola luminosa	Litebox Lumina (dickblick.com)	55305-2009	Nota lampadine di ricambio acquistate anche su Blick (55305.0100)
Pinza per microdissezione	Stoelting	Codice: 52102-43	4 pollici, 1x2 0,5 mm, curva leggera
Pinza per microdissezione	Stoelting	Codice: 52102-06	4 pollici, dritto fine, affilato
Forbici a molla per micro dissezione vannas	Stoelting	52130-01P	Forbici a molla McPherson-Vannas, 8,5 cm, punta 0,33, curva leggera
Microscopio da dissezione	Leica Microsystems	MZ16 o M60	Abbiamo avuto successo con i modelli elencati. Le sorgenti luminose flessibili esterne a collo d'oca sono utili ma non necessarie.
Provette coniche da 50 mL	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS4558
Soluzione salina tamponata con fosfato	Gibco (ThermoFisher Scientific)	10010023	Acquistiamo dalla nostra struttura universitaria Tissue Culture Core, sono disponibili opzioni alternative come questa.
Soluzione salina tamponata con fosfato 10X	Teknova	P0195	Per la preparazione del tampone di lavaggio utilizziamo 10X PBS
Miscela di nutrienti DMEM/F-12 (prosciutto) con GlutaMAX	Gibco (Tecnologie per la vita)	Codice 10565-018	Acquistiamo questa specifica formulazione di terreno, contenente 2,438 g/L di bicarbonato di sodio, 55 mg/L di piruvato di sodio e 4,5 g/L di glucosio
Gentamicina	Thermofisher Scientifico	15710072	Stock 1000X. Si consiglia di preparare e conservare le aliquote a -20 °C per evitare il gelo/disgelo.
Penicillina/Streptomicina	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Codice: 15140-122	Stock 100X. Si consiglia di preparare e conservare le aliquote a -20 °C per evitare il gelo/disgelo.
Amfotericina B	Gibco (ThermoFisher Scientific)	Codice 15290-018	500X stock. Si consiglia di preparare e conservare le aliquote a -20 °C per evitare il gelo/disgelo.
progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Una soluzione madre da 1 mM viene prodotta ricostituendo 15,7 mg di polvere di progesterone in 15,7 mL di etanolo e aggiungendo 34,3 mL di PBS. La soluzione viene filtrata in modo sterile, aliquotata e conservata a -20 °C.
17β-estradiolo	Sigma-Aldrich	E2758	Una soluzione madre da 10 μM viene prodotta ricostituendo 13,5 mg di polvere di estradiolo in 10 mL di etanolo e aggiungendo 40 mL di PBS. La soluzione viene filtrata in modo sterile, aliquotata e conservata a -20 °C.
Filtro sottovuoto per flaconi (0,22 μm)	Sigma-Aldrich (Corning)	CLS430769	Per la filtrazione sterile dei terreni di raccolta dopo la preparazione
piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti	Falco BD	353224	Polistirolo, Coltura tissutale trattata
Pozzetti a 6 pozzetti	Millipore	PICM03050	Inserto - Membrana in PTFE idrofilo con diametro 30 mm, pori di 0,4 μm
Matrice extracellulare (ad esempio, matrice Matrigel)	BD Bioscienze	354234	Abbiamo utilizzato la matrice Matrigel nei nostri studi. È un solido a temperatura ambiente e a -20 °C. Evitare di ripetere il congelamento/scongelamento. Scongelare il flacone in soluzione viscosa a 4 °C e preparare aliquote da ~300 μl nella cella frigorifera con puntali per pipette refrigerati. Conservare le aliquote a -20 °C.
Paraformaldeide, soluzione acquosa al 16% p/v	Alfa Aesar	Codice 30525-89-4	Per la fissazione dei tessuti, una preparazione fresca di paraformaldeide al 4% viene prodotta diluendo questo stock in PBS.
Incubatore per colture tissutali, mantenuto a 37 °C, 5% CO2, 3% ossigeno (opzionale per colture di organi villosi)			Per alcuni esperimenti, l'ipossia può essere preferita. Questo può essere stabilito in diversi modi, tra cui l'aggiunta di azoto esogeno tramite bombola del gas, tubo Tygon e un regolatore.
Centrifuga da banco