Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
ATTENZIONE: Lavorare con campioni di sangue umano e parassiti della malaria umana richiede misure precauzionali. Indossa sempre un camice da laboratorio e guanti e lavora in un armadio di biosicurezza di livello 2. In caso di esposizione percutanea accidentale alla malaria umana, rivolgersi a Salute e Sicurezza per il trattamento profilattico. Ulteriori considerazioni sulla sicurezza dovrebbero essere messe in atto anche per lavorare con il sangue HIV(+) del virus dell'immunodeficienza umana. Indossare un camice da laboratorio con chiusura posteriore. Doppio guanto (il guanto superiore deve essere in lattice). Eseguire tutte le manipolazioni in una cabina di biosicurezza di livello 2. Non utilizzare vetro o oggetti appuntiti. Non utilizzare un aspiratore. Immergere tutti gli oggetti contaminati in una soluzione di virox o candeggina per almeno 1 ora prima di essere gettati. Lavare tutte le superfici con virox e ultravioletti (UV) per 1 ora dopo l'uso. Si noti che ogni istituzione avrà le proprie norme specifiche di biosicurezza che devono essere seguite. Segnalare tutte le esposizioni accidentali a sangue infetto da HIV a Salute e Sicurezza per la valutazione e la considerazione di un'eventuale profilassi post-esposizione.
Nota: Esistono diversi ceppi di parassiti della malaria P. falciparum. Per questi esperimenti è stato utilizzato l'ITG, ma possono essere utilizzati ceppi diversi. Ottime istruzioni sul congelamento e lo scongelamento dei parassiti Plasmodium falciparum sono disponibili sul sito web MR4.
1. Realizzare RPMI-A per la coltura dei parassiti della malaria
- Preparare RPMI-0 mescolando 950 ml di acqua bidistillata (ddH2O), 1 bustina di polvere del Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640, 6 g di acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico (HEPES), 2 g di bicarbonato di sodio e 1,35 mg di ipoxantina.
- Scongelare il siero umano inattivato termicamente da due donatori diversi. I donatori AB sono i migliori, ma possono essere utilizzati se i parassiti vengono coltivati nei globuli rossi di tipo O (RBC). Capovolgere i tubi per mescolare. Se il siero contiene particolato o è denso, centrifugare a 2.000 giri/min, quindi filtrare la parte liquida utilizzando un'unità filtrante da 0,45 μm.
- Utilizzando un'unità filtrante da 0,2 μm, filtrare 180 ml di RPMI-0, 20 ml di siero umano (10 ml da ciascun donatore) e 0,5 ml di 10 mg/ml di gentamicina.
nota: Il siero umano può ostruire il filtro, quindi potrebbe essere necessaria più di un'unità filtrante.
- Etichettare il flacone medio con RPMI-A, la data e la fonte del siero. Conservare in frigorifero fino al momento del bisogno. RPMI-A può diventare torbido se refrigerato. Questo è normale, ma l'aumento della torbidità è un segno di contaminazione.
nota: La crescita dei parassiti può variare nei diversi sieri dei donatori. È una buona idea testare tutti i lotti di siero umano per una buona crescita dei parassiti prima dell'uso.
2. Preparazione dei globuli rossi umani per la coltura dei parassiti
Nota: I donatori di sangue dovrebbero essere di tipo O.
- Raccogliere 7-10 ml di sangue in provette acido-citrato-destrosio (ACD). Scrivi sull'etichetta l'ID del donatore e la data di prelievo.
- Conservare il sangue a 4 oC fino al momento del bisogno. Usa il sangue per le colture di parassiti entro 1 mese.
- Pulire la parte superiore del tubo con etanolo al 70%. Rimuovere con cautela il tappo e gettarlo. Trasferire il sangue in una provetta da 15 ml. Centrifugare per 3 minuti a 1.000 x g. Rimuovere il plasma per aspirazione.
- Sospendere RBC con un volume uguale di RPMI-0 caldo. Centrifugare per 5 minuti a 1.000 x g. Rimuovere il buffy coat per aspirazione, risospendere in 5 ml di RPMI-0 e ripetere il lavaggio altre 2 volte.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere una quantità sufficiente di RPMI-A per produrre una miscela composta al 50% da globuli rossi in volume.
- Conservare a 4 oC fino al momento del bisogno.
3. Mantenere le Culture dei Parassiti
- Preriscaldare RPMI-A a 37 oC.
- Mettere i parassiti scongelati (vedere il protocollo MR4 per la procedura di scongelamento) in un pallone T25 con 5 ml di RPMI-A e 75 μl di globuli rossi umani lavati per un ematocrito di ~3%. nota: L'ematocrito misura il volume dei globuli rossi rispetto al volume totale. Per calcolare l'ematocrito, misurare il volume dei globuli rossi impaccati rispetto al volume totale del terreno più i globuli rossi. Supponiamo che i parassiti scongelati contribuiscano con 75 μl di globuli rossi. Aggiungendo 150 μl di globuli rossi (che equivale ad aggiungere 75 μl di globuli rossi impaccati) al pallone, si ottiene un totale di 150 μl di globuli rossi in 5 ml di terreno, che equivale a un ematocrito del 3% (150 μl/5.000 μl x 100% = 3%).
- Gasare il pallone per 30 sec con una miscela di gas parassita (1% O2, 3% CO2, saldo N2). Sigillare e posizionare il pallone con il lato largo rivolto verso il basso in un'incubatrice a 37 °C in modo da consentire la massima superficie per lo scambio di gas.
- Per cambiare il terreno e verificare la presenza di parassitemia (deve essere fatto quotidianamente), spostare con cautela il pallone in modo da non disturbare lo strato di globuli rossi. Utilizzando una pipetta Pasteur sterile non collegata, prelevare il terreno di coltura senza disturbare lo strato di sangue.
- Per controllare la parassitemia, rimuovere un campione di 10 μl dallo strato di sangue, posizionarlo su un vetrino e, utilizzando un secondo vetrino, creare un sottile film di sangue. Lasciare asciugare lo scivolo.
- Versare 4 ml di RPMI-A fresco nel pallone, mescolare delicatamente, gasare per 30 secondi e porre in un'incubatrice a 37 °C.
- Colorare il vetrino utilizzando il kit di colorazione Hema3 secondo il protocollo del produttore.
- Per una colorazione ottimale, immergere i vetrini nella soluzione di fissaggio per 10 secondi, nella soluzione I per 10 secondi e nella soluzione II per 30 secondi. Sciacquare in acqua e lasciare asciugare i vetrini.
- Calcola la parassitemia contando il numero di globuli rossi di Plasmodium falciparum, PfRBC (colorato di viola scuro) rispetto al numero totale di globuli rossi (colorati di rosa). Conta un totale di 300 celle per garantire la precisione.
- Quando i parassiti hanno raggiunto una parassitemia del 5%, espandere la coltura in un pallone T75, utilizzando 40 ml di RPMI-A e 500 μl di globuli rossi.
4. Sincronizzazione dei parassiti
Nota: Il giorno prima dell'esperimento, sincronizza la coltura del parassita trattandola con alanina. Solo i parassiti allo stadio anulare e i globuli rossi non infetti sopravvivono a questo trattamento. La sincronizzazione dell'alanina ti darà una coltura di trofozoiti pura il giorno successivo che può essere utilizzata negli esperimenti di co-coltura. Assicurati di iniziare con una coltura parassitaria che contenga la maggior parte dei parassiti allo stadio anulare.
- Preparare la soluzione di alanina mescolando 8,01 g di alanina (300 mM) e 0,365 g di Tris (10 mM) in 300 ml di ddH2O. Portare il pH a 7,4. Sterilizzare con filtro utilizzando un'unità filtrante da 0,2 μm.
- Preriscaldare la soluzione di alanina a 37 oC.
- Centrifugare la coltura antiparassitaria (5 min x 1.000 x g) e rimuovere il terreno.
- Risospendere il pellet in 19 volumi di soluzione di alanina (1 ml di globuli rossi confezionati in 19 ml di soluzione di alanina). Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Centrifuga 5 min x 1.000 x g. Aspirare surnatante. Lavare in RPMI-0 una volta. Aspirare il surnatante e risospendere in RPMI-A e regolare l'ematocrito a ~3%. Pallone di gas e ritorno a 37 oC.
nota: Per gli esperimenti di co-coltura, è necessaria una parassitemia minima del 5% di trofozoiti, con una parassitemia del 10% considerata ottimale.
5. Preparazione di parassiti e globuli rossi per esperimenti di co-coltura
- Utilizzare un rapporto di 3 PfRBC per PBMC in esperimenti di co-coltura per indurre una risposta infiammatoria. Per calcolare la PfRBC totale, quantificare la parassitemia eseguendo un sottile striscio di sangue come descritto in 3.5 e l'ematocrito contando il numero di globuli rossi per mL di coltura del parassita utilizzando un emocitometro.
Numero di PfRBC = % parassitemia x globuli rossi totali/ml x ml di coltura. Ad esempio, 10 ml di coltura a 10 x 106 globuli rossi/ml e 10% di parassitemia equivalgono a 0,1 x 106/ml x 10 ml = 10 x 106 PfRBC.
- Centrifugare la coltura antiparassitaria per 5 minuti a 1.000 x g (RT). Aspirare il terreno e risospendere a 6 x 106 PfRBC per ml in RPMI-S+ (500 ml di RPMI-1640 integrati con L-glutammina e HEPES, 10% di siero fetale bovino inattivato a caldo (FBS), 1,5 ml di gentamicina, 5 ml di 100 mM di piruvato di sodio, 5 ml di 10 mM di aminoacidi non essenziali MEM, 5 ml di 5 mM di β-mercaptoetanolo).
- Prelevare il sangue di controllo (globuli rossi non infetti dallo stesso donatore utilizzato per mantenere la coltura del parassita), calcolare l'ematocrito e risospendere in RPMI-S+ allo stesso numero di globuli rossi per ml della coltura del parassita.
6. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico umano (PBMC)
- Raccogliere il sangue venoso in provette di eparina sodica (parte superiore verde) sia da un donatore cronico HIV(+) che da un controllo HIV(-). Non utilizzare l'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) come anticoagulante poiché l'azione chelante del calcio EDTA influisce sulla funzione cellulare. In media, ci si aspetta tra 5-10 x 106 PBMC per 10 ml di sangue. Per un tipico esperimento, raccogli 30 ml di sangue da ogni donatore. Il volume del sangue dovrà essere regolato in base ai requisiti sperimentali.
- Il più rapidamente possibile e sicuramente entro un'ora dal prelievo del sangue, rimuovere il sangue dalle provette e metterlo in una provetta di plastica da 50 ml. I monociti, in particolare, si attivano e si attaccano al vetro, quindi è importante che se si utilizzano provette per la raccolta del sangue in vetro, le cellule vengano rimosse il più rapidamente possibile.
- Centrifugare il sangue a 1.000 x g per 15 minuti e raccogliere il plasma (questo può essere utilizzato per altri studi, se necessario, in caso contrario questo passaggio può essere saltato). Diluire il sangue in un volume uguale di soluzione salina fredda tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS).
- Mettere 15 ml di RT Ficoll in un tubo da 50 ml. Lentamente, utilizzando una pipetta di trasferimento sterile in plastica, sovrapporre la soluzione di sangue/DPBS sul Ficoll senza mescolare. Un massimo di 25 ml di soluzione di sangue/DPBS possono essere stratificati su ogni 15 ml di Ficoll.
- Centrifuga le pendenze per 30 minuti a RT a 600 x g. Assicurati che l'impostazione "nessun freno" sia attiva.
- Una volta che le celle hanno girato, cerca l'interfaccia tra le due fasi. È qui che si trovano i PBMC. Utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica sterile, prelevare la PBMC dall'interfaccia (vedere la Figura 1). Ridurre al minimo la contaminazione da globuli rossi.
- Mettere le cellule raccolte in provette da 50 ml, con non più di 20 ml per provetta. Provetta orizzontale fino a 50 ml con DPBS sterile a freddo.
- Centrifugare le celle per 10 minuti a 4 oC a 300 x g.
- Scartare il surnatante, risospendere il pellet in 5 ml di DPBS sterile a freddo e raggruppare tutte le cellule dello stesso donatore in un'unica provetta. Rabboccare fino a 50 ml con DPBS sterile e ripetere le fasi di lavaggio altre 2 volte.
- Risospendere le cellule in 10 ml di terreno RPMI-S+.
- Prelevare un'aliquota di 20 μl e mescolarla con 20 μl di blu di tripano. Pipettare 10 μl in un emocitometro e contare le cellule viventi (cellule che non hanno assorbito il colorante blu – tutte le cellule blu sono morte). Utilizzare un emocitometro per calcolare il numero di cellule in una soluzione come segue.
nota: Un emocitometro ha una griglia di dimensioni specificate in modo che l'area coperta dalle linee sia nota.
- Assicurarsi che l'emocitometro sia pulito. Posizionare il vetrino coprioggetti sull'area di conteggio. Caricare 10 μl di soluzione cellulare posizionando il puntale della pipetta in uno dei pozzetti a forma di V. L'area sotto il vetrino coprioggetti sarà riempita per azione capillare.
- Posizionare l'emocitometro carico sotto un microscopio. La griglia completa dell'emocitometro contiene 9 quadrati di 1 mm2 ciascuno. Conta tutte le celle all'interno di ogni quadrato grande. Se sono presenti troppe cellule, diluire ulteriormente la soluzione e contare.
- Calcolare la concentrazione delle cellule come segue: Cellule totali/ml = (totale delle cellule contate/# di quadrati) x fattore di diluizione x 10.000 cellule/ml, ad esempio (500 cellule/5 quadrati) x fattore di diluizione di 20 x 10.000 cellule/ml = 20 x 106 cellule totali.
- Regolare il terreno su una concentrazione finale di 10 x 106 per ml (terreno RPMI-S+).
7. Cultura della coinfezione da malaria/HIV
- Piastra 100 μl di PBMC isolate e 400 μl di terreno RPMI-S+ su una piastra a 24 pozzetti (1 x 106 PBMC per pozzetto). Assicurarsi che i pozzetti siano disposti in triplice copia: 3 pozzetti per globuli rossi non infetti, 3 pozzetti con PfRBC, 3 pozzetti con terreno e 3 pozzetti con PMA/ionomicina. Questo vale sia per i campioni HIV(+) che per quelli HIV(-).
- Per i pozzetti di PfRBC, collocare 3 x 106 PfRBC in ciascuno dei pozzetti (500 μl di coltura di parassiti preparata in 5.2).
- Per i pozzetti di globuli rossi non infetti, collocare 500 μl della coltura di globuli rossi non infetti preparata in 5.3 in ciascuno dei pozzetti.
- Per pozzetti medi, posizionare 500 μl di terreno RPMI-S+ in ciascuno dei pozzetti.
- Per i pozzetti di PMA/ionomicina, preparare una soluzione di PMA/iocomicina (rispettivamente 2,5 pg/ml, 250 pg/ml). Mettere 500 μl di questa soluzione in ogni pozzetto.
nota: Come potenti stimolatori della secrezione di citochine delle cellule T, la PMA e la ionomicina sono utilizzate come controlli positivi per garantire la funzionalità delle cellule.
- Posizionare la piastra a 37 oC in un'incubatrice al 5% di CO2.
- Facoltativo: utilizzare le cellule in eccesso per l'analisi fenotipica utilizzando la citometria a flusso o conservarle in una soluzione di stabilizzazione dell'RNA per future analisi dell'espressione dell'mRNA.
8. Rilevamento delle risposte immunitarie alla malaria
Nota: Esegui esperimenti di co-coltura per un massimo di 4 giorni. Durante questo periodo non è richiesto alcun cambio di fluido. Il punto temporale ottimale dipenderà dal tipo di cellula di interesse e dalla domanda posta. Un'incubazione di 12-48 ore è ottimale per le risposte monocitiche ai PfRBC, mentre le risposte dei linfociti sono state osservate al meglio a 72-96 ore. I punti temporali dovranno essere ottimizzati in base alla domanda sperimentale. Periodi più brevi (2-4 ore) possono essere utilizzati se l'interazione tra PfRBC intatto e PBMC è di interesse.
- Centrifugare la piastra a 300 x g per 3 minuti per pellettare le celle. Raccogliere 700 μl di surnatante di coltura da ciascun pozzetto.
- Centrifugare il surnatante a 1.000 x g per 5 minuti per rimuovere eventuali detriti.
- Aliquotare il surnatante chiarificato secondo necessità, etichettare e congelare a una temperatura inferiore a -20 °C fino a quando non è necessario eseguire l'analisi dei fattori secreti.
