Induzione della malattia del trapianto contro l'ospite in modelli murini tramite trapianto allogenico di midollo osseo e cellule spleniche

Abstract

Fonte: Buchele, V., et al. Induzione della malattia del trapianto intestinale contro l'ospite e la sua valutazione mini-endoscopica in topi vivi. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video dimostra l'induzione della malattia intestinale del trapianto contro l'ospite, GvHD, in un topo ricevente irradiato letalmente utilizzando cellule staminali ematopoietiche allogeniche e linfociti T alloreattivi splenici che inducono GvHD. Questo protocollo aiuta a stabilire un modello di GvHD intestinale acuta grave per comprendere il meccanismo della malattia e sviluppare opzioni terapeutiche innovative.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Induzione GvHD

1. Giorno 0: Irradiazione corporea totale dei topi riceventi
   1. Utilizzare come riceventi topi femmina CD45.2+ H2kd+ BALB/c di almeno 10 settimane.
   2. Pesare e registrare il peso dei topi riceventi prima dell'induzione della GvHD.
      nota: Assicurarsi che il ricevente abbia un peso corporeo minimo di 20 g. Il peso corporeo iniziale servirà come valore di riferimento per calcolare la perdita di peso del singolo topo nel corso dell'induzione e della progressione della GvHD.
   3. Posizionare fino a cinque topi nel contenitore dell'irradiatore di raggi X.
   4. Irradiare i topi mediante irradiazione totale del corpo con una singola dose di 8 Gy di raggi X. Utilizzare Cs137 come sorgente di radiazioni.
2. Giorno 1: Ricostituzione dei topi irradiati con midollo osseo impoverito di cellule T
   nota: Il trapianto di cellule allogeniche del midollo osseo, come descritto e dettagliato nella sezione 1.2, deve avvenire entro 24 ore dall'irradiazione. Eseguire le procedure descritte di seguito in una cappa di coltura tissutale sterile e utilizzare reagenti filtrati. Utilizzare CD45.1/Ly5.1 B6 allogenico. Topi SJL-Ptprca Pepcb/BoyCrl come donatori di midollo osseo impoverito con cellule T.
   1. Eutanasia CD45.1/Ly5.1 B6. Topi SJL che doneranno cellule allogeniche del midollo osseo in conformità con le linee guida istituzionali, 12-24 ore dopo l'irradiazione dei topi BALB/c riceventi. Per questo, anestetizzare il CD45.1/Ly5.1 B6. Topi SJL per inalazione di isoflurano al 5%. Continuare con l'esposizione all'isoflurano per oltre 1 minuto dopo l'arresto respiratorio e confermare l'eutanasia per lussazione cervicale.
   2. Disinfettare accuratamente il pelo e la pelle del topo con etanolo al 70%.
   3. Posizionare il mouse su una guaina di lavoro pulita in modo che il mouse sia in posizione prona, con i quarti posteriori rivolti verso lo sperimentatore. Solleva la pelliccia al tallone d'Achille con la punta della pinza Semken con una lunghezza di 13 cm e punte curve seghettate. Incidere la pelle tra la pinza e il tallone con forbici fini temprate da 8,5 cm con punte dritte.
   4. Allungare l'incisione cranialmente (cioè dal tallone alla parte inferiore della gamba e della coscia fino alla regione dell'anca). Rimuovere la pelle e il pelo dall'arto posteriore con l'aiuto del forcipe.
   5. Eseguire la stessa procedura sull'altro arto posteriore.
   6. Rimuovere gli arti posteriori tagliando le articolazioni dell'anca adiacenti.
   7. Taglia via le zampe posteriori. Tagliare l'articolazione del ginocchio. Conservare la coscia e lo stinco di ogni arto posteriore insieme in una capsula di Petri da 92 mm riempita con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) su ghiaccio.
   8. Pulisci accuratamente le ossa del femore e della tibia rimuovendo quanto più tessuto muscolare possibile da ogni coscia e stinco. Trasferire le ossa del femore e della tibia in una provetta da 50 ml riempita con terreno sterile RPMI 1640 e posizionarla su ghiaccio umido fino a quando tutte le ossa della tibia e del femore raccolte nella fase 1.2.7 non sono state ripulite dal tessuto muscolare.
   9. Per isolare il midollo osseo, trasferire un osso del femore o della tibia alla volta (che è stato pulito come descritto al punto 1.2.8) dalla provetta da 50 mL a una piastra di Petri (con un diametro di 92 mm) riempita con terreno RPMI 1640. Tagliare le estremità del femore o della tibia con un bisturi per accedere alla cavità dell'osso contenente il midollo osseo.
   10. Preparare una provetta di raccolta da 50 mL con 5 mL di terreno RPMI 1640. Inserire un ago da 26 G collegato a una siringa da 1 mL riempita con 1 mL di terreno RPMI 1640 nella cavità ossea e lavare il midollo osseo fuori dalla cavità nella provetta di raccolta spingendo lo stantuffo.
   11. Ripetere il passaggio 1.2.10 fino a quando l'osso appare leggero e lucido (cioè, la cavità ossea è visibilmente priva di midollo osseo rossastro). Scartare l'osso vuoto.
   12. Ripetere i passaggi 1.2.9 - 1.2.11, utilizzando tutte le ossa del femore e della tibia del passaggio 1.2.8, e raccogliere tutti i pezzi di midollo osseo recuperati nella stessa provetta di raccolta da 50 ml del passaggio 1.2.10. Tenere la provetta di raccolta su ghiaccio umido fino a quando tutte le ossa del passaggio 1.2.8 non sono state lavorate di conseguenza.
   13. Creare una sospensione unicellulare pipettando delicatamente i pezzi di midollo osseo sbriciolati e lavati su e giù. Filtrare la sospensione unicellulare del midollo osseo attraverso un filtro a rete da 40 μm posizionato su una nuova provetta di raccolta da 50 mL.
   14. Centrifugare la provetta di raccolta da 50 mL contenente la sospensione monocellulare del midollo osseo a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
   15. Risospendere il pellet in 5 mL di tampone di lisi ACK (1 mM Na²EDTA; 10 mM KHCO₃; 144 mM NH₄Cl; pH 7,2) per la lisi dei globuli rossi. Incubare la sospensione cellulare per 3 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere immediatamente 10 mL di soluzione di PBS alla sospensione cellulare.
   16. Centrifugare la sospensione a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di soluzione di PBS.
   17. Contare le cellule del midollo osseo, utilizzando un emocitometro. Conservare un'aliquota di 6 x 10⁶ cellule per l'analisi di citometria a flusso per verificare la purezza delle cellule dopo la purificazione cellulare (vedere il passaggio 1.2.20).
   18. Per la deplezione delle cellule T dalla sospensione di singole cellule del midollo osseo, utilizzare un kit di purificazione cellulare disponibile in commercio. Esaurimento magnetico delle cellule CD90.2+ (cioè dei linfociti) dalle cellule totali del midollo osseo, seguendo il protocollo del produttore.
   19. Contare le cellule del midollo osseo deplete di cellule T che sono state isolate come descritto al punto 1.2.18, utilizzando un emocitometro. Conservare un'aliquota di 1 x 106 cellule per l'analisi della citometria a flusso da eseguire successivamente, come descritto al punto 1.2.20.
       nota: La resa cellulare media derivata da un topo donatore è solitamente compresa tra 2 x 107 e 3,4 x 107 cellule del midollo osseo impoverite di cellule T.
   20. Confermare la corretta deplezione delle cellule T mediante citometria a flusso. Colorare 1 x 10⁶ cellule, conservate dagli step 1.2.17 (cellule del midollo osseo prima della separazione magnetica) e 1.2.19 (cellule del midollo osseo impoverite dalle cellule T dopo la separazione magnetica delle cellule), con i seguenti anticorpi: α-CD45.1 (A20), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7). Utilizzare le cellule rimanenti del passaggio 1.2.17 come controllo non colorato e per i controlli a colorazione singola, per impostare il citometro a flusso.
       1. Trasferire 1 x 10⁶ cellule da ciascun campione a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo a V per eseguire la procedura di colorazione citofluorimetrica.
       2. Centrifugare le cellule all'interno della piastra a 96 pozzetti (passaggio 1.2.20.1) a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μl di tampone FACS (PBS integrato con siero bovino filtrato al 3%).
       3. Centrifugare le cellule all'interno della piastra a 96 pozzetti a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
       4. Aggiungere una quantità appropriata dell'anticorpo scelto (confrontare con il passaggio 1.2.20) ai campioni per la colorazione singola in 100 μl di tampone FACS.
       5. Preparare una miscela di tutti gli anticorpi (master mix) contenente le quantità appropriate sufficienti per colorare separatamente le aliquote delle cellule del midollo osseo conservate dalla precedente (cfr. punto 1.2.17) e successiva (cfr. punto 1.2.19) alla deplezione magnetica delle cellule T. Aggiungere 100 μl della miscela master a entrambe le aliquote.
       6. Aggiungere solo 100 μl di tampone FACS al campione non colorato.
       7. Incubare le cellule all'interno della piastra a 96 pozzetti per 20 minuti a 4 °C al buio.
       8. Aggiungere 100 μl di tampone FACS e centrifugare le cellule all'interno della piastra a 96 pozzetti a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μl di tampone FACS.
       9. Centrifugare le cellule a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere le cellule in 250 μl di tampone FACS.
       10. Trasferire i campioni in una provetta a fondo tondo in polistirene da 5 mL e analizzarli con uno strumento citofluorimetro in grado di rilevare le molecole fluorescenti utilizzate per marcare gli anticorpi impiegati per caratterizzare i campioni cellulari (vedere il passaggio 1.2.20).
       11. Confronta la composizione cellulare prima e dopo la separazione magnetica delle cellule.
           nota: Di solito si ottiene una purezza di circa il 95% di cellule CD45.1+CD3- (cioè di midollo osseo impoverite con cellule T) all'interno del cancello vivo.
   21. Lavare le sospensioni di cellule del midollo osseo impoverite di cellule T 2 volte con una soluzione di PBS (450 x g per 5 minuti a 4 °C) e, infine, risospendere le cellule in soluzione di PBS, regolando la concentrazione cellulare a 5 x 10⁷ cellule/mL. Mantenere le cellule sul ghiaccio umido fino all'iniezione.
   22. Iniettare cellule del midollo osseo impoverite di cellule T nei topi riceventi, che sono stati irradiati il giorno prima (vedere paragrafo 1.1).
       1. Posizionare il topo sperimentale in una camera a prova di perdite e indurre l'anestesia per inalazione di isoflurano fino al 4%, fino a quando il topo non perde conoscenza. Confermare l'analgesia e la perdita di coscienza testando la perdita del riflesso di raddrizzamento e la successiva perdita del riflesso di ritiro del pedale.
       2. Iniettare 5 x 10⁶ cellule di midollo osseo impoverite di cellule T (cioè 100 μL di 5x10⁷ cellule/mL) contenenti soluzione di PBS utilizzando una siringa da 1 ml dotata di un ago da 30 G per via endovenosa nello spazio retrobulbare contenente il seno venoso.
3. Giorno 2: Trasferimento delle cellule T
   nota: Eseguire le procedure descritte di seguito in una cappa di coltura tissutale sterile e utilizzare reagenti filtrati. Utilizzare CD45.2 C57Bl/6 (wild-type; WT) come donatori di cellule T alloreattive. L'utilizzo di sistemi di marcatori congenici consente di distinguere tra i tipi di cellule ematopoietiche riceventi (CD45.2+ H2kd+ Balb/c) e donatrici (cellule del midollo osseo: CD45.1+ H2kb+ B6). topi SJL; cellule T allogeniche: topi CD45.2+ H2kb+ C57/Bl6).
   1. Eutanasia dei topi C57Bl/6 in conformità con le linee guida e le autorità istituzionali applicabili. Pertanto, anestetizzare i topi per inalazione con una concentrazione del 5% di isoflurano. Continuare l'esposizione all'isoflurano fino a 1 minuto dopo l'arresto respiratorio e confermare l'eutanasia per lussazione cervicale. Disinfettare accuratamente il pelo e la pelle del topo con etanolo al 70%.
   2. Posizionare un colino con uno schermo a rete da 40 μm su una provetta di raccolta da 50 mL. Togliete la milza e mettetela sul colino.
   3. Con uno stantuffo della siringa, sminuzzare la milza nel colino. Lavare il colino e lo stantuffo della siringa con PBS per raccogliere tutti gli splenociti.
   4. Centrifugare le cellule all'interno della provetta di raccolta da 50 mL a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Eliminare il surnatante.
   5. Risospendere gli splenociti in 3 mL di tampone di lisi ACK per lisare i globuli rossi. Incubare la sospensione cellulare per 3 minuti. Successivamente, aggiungere 10 mL di PBS e centrifugare le cellule a 450 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere gli splenociti in PBS.
   6. Contare le cellule della milza, utilizzando un emocitometro. Deviare un'aliquota di 6 x 10⁶ cellule per l'analisi della citometria a flusso, per valutare l'entità della purificazione nella fase 1.3.9.
   7. Per un isolamento totale delle cellule T CD3+ dagli splenociti totali, utilizzare un kit di purificazione cellulare disponibile in commercio. Isolare le cellule T spleniche, seguendo il protocollo del produttore.
   8. Contare le cellule T CD3+ spleniche isolate come descritto al punto 1.3.7, utilizzando un emocitometro. Conservare un'aliquota di 1 x 10⁶ cellule T per l'analisi della citometria a flusso.
      nota: La resa media di cellule T spleniche per topo donatore isolato mediante separazione magnetica delle cellule varia da 1,3 x 10⁷ a 2 x 10⁷ cellule.
   9. Confermare il successo dell'isolamento delle cellule T mediante citometria a flusso. Per una descrizione dettagliata del protocollo di colorazione, consultare e seguire i passaggi 1.2.20.1 - 1.2.20.10.
      1. Colorare 1 x 10⁶ splenociti dei passaggi 1.3.6 (prima della separazione delle cellule magnetiche) e 1.3.8 (dopo la separazione delle cellule magnetiche) con i seguenti anticorpi: α-CD45.2 (104), α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) e α-CD8α (53-6.7).
      2. Utilizzare le cellule rimanenti del passaggio 1.3.6 come controllo non colorato e per la colorazione singola con i rispettivi anticorpi, per impostare il citometro a flusso.
      3. Confronta la composizione cellulare prima e dopo la separazione magnetica delle cellule.
         nota: Deve essere raggiunta una purezza del ≥95% delle cellule T CD45.2+CD3+ all'interno del cancello vivo dei linfociti.
   10. Lavare le cellule T 2 volte con PBS (450 x g per 5 minuti a 4 °C) e, infine, risospendere le cellule in soluzione di PBS, regolando la concentrazione delle cellule a 7 x 10⁶ cellule/mL. Mantenere le cellule in ghiaccio fino all'iniezione.
   11. Iniettare cellule T spleniche alloreattive (vedere passaggio 1.3.10) in topi BALB/c irradiati che hanno precedentemente ricevuto cellule del midollo osseo impoverite con cellule T CD45.1+ (vedere passaggio 1.2.22).
       1. Indurre l'anestesia posizionando il topo sperimentale in una camera a prova di perdite in cui è esposto fino al 4% di isoflurano fino a quando non perde conoscenza. Confermare l'analgesia e la perdita di coscienza testando la perdita del riflesso di raddrizzamento e la successiva perdita del riflesso di ritiro del pedale.
       2. Iniettare 0,7 x 10⁶ cellule T CD3+ alloreattive utilizzando una siringa da 1 mL dotata di un ago da 30 G (cioè 100 μL di 7 x 10⁶ cellule/mL) contenente una soluzione di PBS (vedere passaggio 1.3.10), per via endovenosa nello spazio retrobulbare dei topi, per indurre la GvHD. Denominare questi topi come il gruppo sperimentale.
       3. Iniettare un diverso gruppo di topi con 100 μL di PBS da solo, per via endovenosa, nello spazio retrobulbare, e denominare questo gruppo come gruppo di controllo, successivamente chiamato "topi senza trapianto di cellule T (noT)".

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Irradiatore gamma BIOBEAM 2000	Gamma-Service Meical GmbH
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich Co. LLC.	D8662-6x500ML
Pinze Semken (lunghezza: 13 cm; punte seghettate e curve)	Strumenti per la scienza	Codice 11009-13
Forbici fini temprate (lunghezza: 8,5 cm; punte dritte; tagliente: 24 mm)	Strumenti per la scienza	Codice 14090-09
RPMI-1640 Medio	Sigma-Aldrich Co. LLC.	R8758-500ML
Ago ipodermico (26G)	B. Braun Melsungen AG	4657683
Siringa da 1 ml	B. Braun Melsungen AG	9166017V
Provetta da 50 mL	Sarstedt Ag & Co.KG	6,25,47,254
Filtro cellulare con schermo a maglie da 40 μm	Falco BD	Codice 352340
Siringa da insulina con interno sterile (30G)	Bd	324826
Kit di isolamento delle cellule Pan T II, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	Codice 130-095-130	separazione di celle magnetiche per isolare le cellule T spleniche
CD90.2 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotec GmbH	Codice 130-049-101	separazione di cellule magnetiche per isolare le cellule del midollo osseo impoverite di cellule T
Pinze per biopsia	KARL STORZ SE &co KG	61071 ZJ	Parte del setup sperimentale per la colonscopia
Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (Na2EDTA)	Carl Roth GmbH & Co.KG	8043.2	ingrediente del tampone di lisi ACK
Alexa Fluor 700 anti-topo CD45.2 Anticorpo (clone: 104; lotto: B252126; Codice RRID: AB_493731)	Bioleggenda	109822
PE/Cy7 anti-topo CD45.1 Anticorpo (clone: A20; lotto: B217246; RRID: AB_1134168)	Bioleggenda	Codice 110730
APC/Cy7 anti-topo CD8a Anticorpo (clone: 53-6.7, lotto: B247008; RRID: AB_312753)	Bioleggenda	100714
Forano / Isofluran	AbbVie Inc.	B506
Siero bovino filtrato	Pan Biotec	P40-47500	ingrediente del tampone FACS