1. Purificazione in vitro di sporozoiti da oocisti di C. parvum
- Purificare gli sporozoiti dalle oocisti di C. parvum dopo aver sbiancato e lavato via la candeggina come descritto sopra.
- Trasferire le oocisti in una provetta da 15 ml. Risospendere le oocisti in un mezzo di escissione a temperatura ambiente (0,75% p/v taurocolato di sodio in DMEM) per ottenere 1 x 107 oocisti/mL. L'aggiunta di taurocolato migliora il tasso di escissione delle oocisti, migliorando la resa in sporozoiti.
- Incubare la sospensione di oocisti a 37 °C per 1–1,5 h.
- Controllare il campione al microscopio per l'entità dell'escistazione; l'escisazione del 60-80% è ragionevole per un buon recupero degli sporozoiti. Se il livello di escisazione è basso, incubare più a lungo (da 30 minuti a 1 ora).
- Determinare la percentuale di escisazione relativa al numero di oocisti iniziali. L'escissione è calcolata come:
% di escissione = [1 – (numero di oocisti intatte/numero di oocisti all'inizio)] x 100
- Lavare le cellule per rimuovere i reagenti di escistazione aggiungendo 14 ml di PBS o terreno, mescolando e recuperando le cellule (oocisti intatte, gusci di oocisti e sporozoiti) mediante centrifugazione a 3.400 x g per 20 minuti per recuperare gli sporozoiti. Aspirare con cura per evitare di perdere le cellule.
- Risospendere il pellet di sporozoite in 1-2 mL di DMEM per ottenere 3 x 107 oocisti/mL (in base al numero di oocisti iniziali).
- Per rimuovere le oocisti e i gusci rimanenti, filtrare la sospensione attraverso un filtro da 3 μm (Figura 1B). Utilizzare un apparecchio portafiltro da 47 mm dotato di un filtro in policarbonato (dimensione dei pori di 3 μm) collegato a un cilindro siringa da 10 ml. Posizionare l'apparecchio portafiltro sopra una provetta da 15 mL. Posizionare il gruppo in un secchiello per il ghiaccio o in una cella frigorifera.
- Aggiungere 7,5 mL della sospensione di sporozoite al gruppo filtro e lasciarla filtrare per gravità. Lavare con altri 7,5 mL di DMEM.
nota: Per garantire il successo nell'isolamento degli sporozoiti, sono fondamentali oocisti fresche e una buona escissione. Se ci sono troppe oocisti non espulse, la sospensione non fluirà per gravità. L'applicazione di pressione sulla siringa può forzare il passaggio di oocisti non tagliate. La microiniezione di sporozoiti è più impegnativa di quella delle oocisti perché gli sporozoiti possono aggregarsi e bloccare il capillare. Per evitare ciò, si consiglia di realizzare una punta capillare più larga quando si iniettano organoidi con sporozoiti. Per raggiungere livelli sufficienti di infezione, è necessario iniettare 2-4 volte il numero di sporozoiti in ciascun organoide rispetto agli organoidi infettati da oocisti.
- Centrifugare la sospensione di sporozoite filtrata a 3.400 x g utilizzando un rotore a secchiello oscillante per 20 minuti per pellettare gli sporozoiti.
- Risospendere in 50-100 μL di terreno di coltura per organoidi OME o OMD (vedere la Tabella dei materiali) integrato con colorante Fast Green allo 0,05% (p/v) e L-glutatione, betaina, L-cisteina, acido linoleico e tampone riducente contenente taurina (vedere la Tabella dei materiali).
nota: L'incubazione delle oocisti per troppo tempo può provocare la lisi degli sporozoiti e uno scarso recupero e quindi dovrebbe essere evitata.
2. Coltura in vitro di intestino umano per microiniezione
- Coltura di organoidi intestinali in condizioni di terreni di espansione e differenziazione.
NOTA: I dettagli della propagazione intestinale sono stati precedentemente descritti in altri articoli (vedere la Tabella dei materiali per le ricette dei terreni). Qui, descriviamo brevemente il metodo di coltura degli organoidi con specifico riferimento all'ottimizzazione per l'iniezione e la crescita di Cryptosporidium. Abbiamo scoperto che per l'imaging dei parassiti negli organoidi, gli organoidi cresciuti in un mezzo di espansione sono preferibili a quelli cresciuti in mezzi di differenziazione poiché c'è meno accumulo di detriti rispetto a quello osservato negli organoidi cresciuti in un mezzo di differenziazione. Tuttavia, se l'obiettivo è isolare le oocisti, gli organoidi coltivati nei terreni di differenziazione producono un numero molto più elevato di oocisti.
- Mantenere gli organoidi in colture 3D in matrice extracellulare (vedere la Tabella dei Materiali) a 37 °C. Aggiungere OME (mezzi di espansione degli organoidi) e rinfrescare ogni giorno.
- Per dividere e impiattare gli organoidi per microiniezione, rimuovere il terreno dalla piastra a 6 pozzetti contenente organoidi umani, aggiungere F12+++ (vedere la Tabella dei materiali) al pozzetto e rompere la matrice pipettando più volte con un puntale per pipetta da 1 mL. Raccogliere le cellule in una provetta da 15 mL (2 mL di F12+++ per provetta sono sufficienti per ulteriori procedure).
- Aggiungere 10-12 mL di F12+++ in un'altra provetta da 15 mL e posizionare una pipetta di vetro lucidata a fuoco nel terreno, pipettare su e giù 3 volte per rompere gli organoidi intestinali umani.
nota: Utilizzare una pipetta di vetro lunga (20-30 cm) e lucidarla brevemente a fuoco. Non rendere l'apertura (1 mm di diametro) molto piccola perché gli organoidi possono essere danneggiati. Rendere liscia la punta della pipetta lucidandola brevemente a fuoco. Rompere gli organoidi in pezzi più piccoli di ~50 μm.
- Aggiungere F12+++ fino a 5–7 mL e centrifugare a 350 x g per 5 min.
nota: La velocità di centrifugazione in questa fase è superiore al normale per produrre un buon pellet cellulare ben separato dalla matrice extracellulare (vedi Tabella dei materiali). Abbiamo osservato che, rispetto agli organoidi dell'intestino tenue di topo, gli organoidi dell'intestino tenue umano sono più difficili da distruggere.
- Rimuovere quanto più terreno possibile senza disturbare le cellule, quindi risospendere il pellet con matrice mantenuta a 4 °C; sono necessari 200-300 μL di matrice per pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Gli organoidi dovrebbero essere divisi uno in tre per mantenere una densità cellulare abbastanza elevata.
- Piastra gli organoidi in goccioline di matrice di circa 5-10 μl ciascuna nel pozzetto di una piastra a sei pozzetti. Incubare per 20-30 minuti a 37 °C e poi aggiungere sopra il terreno di espansione (OME).
- Cambia il mezzo ogni 2-3 giorni.
nota: In circa 5-7 giorni, gli organoidi che crescono in EM raggiungono una dimensione di 100-200 μm e sono pronti per l'iniezione.
- Per differenziare gli organoidi, dopo 5-6 giorni in EM, cambiare il terreno in condizioni di terreno di differenziazione (DM) e conservarlo per altri 5-6 giorni prima di iniettare i parassiti><.
nota: Per l'espansione degli organoidi, si consiglia di impiattare gli organoidi in modo denso. Per la microiniezione, si raccomanda l'uso di una piastra a sei pozzetti con organoidi placcati a una densità inferiore. Ad esempio, gli organoidi della piastra da tre pozzetti di una piastra a sei pozzetti in una piastra completa a sei pozzetti per le microiniezioni. La matrice deve essere mantenuta a -20 °C per la conservazione a lungo termine e scongelata a 4 °C o su ghiaccio prima dell'uso.
3. Microiniezione di oocisti/sporozoiti nel lume dell'organoide
- Microiniettare i parassiti nel lato apicale dell'organoide 3D (Figura 2).
- Preparare capillari di vetro di 1 mm di diametro utilizzando un estrattore per micropipette.
nota: Le impostazioni utilizzate sull'estrattore per micropipette (vedere la tabella dei materiali) sono Calore = 663, Trazione = 100, Velocità = 200, Tempo = 40 ms. Le impostazioni dovranno essere regolate in base alle istruzioni per l'utente di una particolare macchina.
- Tagliare la punta del capillare con una pinza. La dimensione/diametro dell'estremità capillare misura circa 9-12 μm; Ciò consente un facile flusso di oocisti (dimensioni di 4-5 μm).
- Riempire i capillari con sospensione di oocisti o sporozoite utilizzando le punte del micro-caricatore.
- Caricare il capillare pieno di oocisti su un microiniettore.
- Microiniettare 100-200 nL di sospensione in ciascun organoide al microscopio invertito con un ingrandimento 5x, mantenendo costante la pressione. Dopo la microiniezione, rinfrescare il terreno con OME o OMD (terreno di differenziazione degli organoidi) ogni giorno e mantenere la piastra a 37 °C.
nota: Non utilizziamo un micromanipolatore per la microiniezione. Si raccomanda l'uso dello stesso capillare per l'intero esperimento per garantire un'iniezione uguale in ogni campione.
