$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Infezione
- Infettare le zanzare Anopheles stephensi con Plasmodium berghei ANKA nutrendole per 15 minuti su un topo gametocitemico. Mantenere le zanzare infette all'80% di umidità e a 21 °C.
- Raccogli le zanzare femmine dalla loro gabbia da 17 a 22 giorni dopo il pasto di sangue. Mettetele sul ghiaccio per anestetizzarle.
- Usando una pinza, posiziona tre o quattro zanzare su un vetrino coperto con una goccia di terreno RPMI freddo. Posizionare il vetrino sotto un microscopio.
- Usando il forcipe, allunga con cura la zanzara tra la testa e il corpo. Isolare la ghiandola salivare usando una siringa e un ago. Ripeti questa procedura con le zanzare rimanenti.
- Raccogliere le ghiandole salivari dal vetrino aspirandole con una pipetta di vetro e raccogliendole in una provetta da centrifuga da 1,5 mL.
nota: A seconda dei tassi di infezione, di solito si possono ottenere da 8.000 a 15.000 sporozoiti infettivi per ghiandola salivare.
- Per circa 3 minuti, schiacciare le ghiandole salivari isolate all'interno della provetta da centrifuga con un piccolo bastoncino di plastica per isolare gli sporozoiti dal tessuto delle ghiandole salivari.
- Centrifugare per 3 minuti a 1.000 x g e 4 °C per purificare gli sporozoiti dal tessuto rimanente.
- Pipettare il surnatante, che contiene gli sporozoiti (SPZ), in una nuova provetta da centrifuga e contare gli sporozoiti purificati in un emocitometro Neubauer.
- Regolare la concentrazione di sporozoiti purificati a 10.000/mL aggiungendo soluzione salina tamponata con fosfato.
- Iniettare un totale di 1.000 sporozoiti (0,1 ml) nelle vene della coda di topi consanguinei C57BL/6 per avviare l'infezione. Per facilitare le iniezioni, mettere i topi C57BL/6 in un sistema di contenzione e mettere le code in acqua calda (circa 37 °C) per facilitare la visualizzazione delle vene della coda.
nota: L'iniezione stessa è una procedura breve che può essere eseguita in pochi secondi.
- Una volta al giorno, controllare la parassitemia allo stadio ematico sugli strisci di sangue dal giorno 3 in poi dopo l'infezione da SPZ.
- Valutare i topi una volta al giorno con il punteggio RMCBS (Rapid Murine Coma and Behavior Scale), a partire dal giorno 5 dopo l'iniezione di sporozoiti.
- Valutare i topi con la risonanza magnetica (MRI) in base al punteggio RMCBS (Rapid Murine Coma and Behavior Scale) e alla domanda di ricerca da affrontare.