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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Macrofagi di lavaggio broncoalveolare (BAL)
- Utilizzare BAL per ottenere macrofagi polmonari in (1) soggetti umani mediante broncoscopia e (2) topi utilizzando l'aspirazione intra-tracheale.
nota: L'acquisizione dei macrofagi provoca generalmente una certa attivazione di queste cellule. I macrofagi sono ottenuti da pazienti che richiedono una broncoscopia per indagare un potenziale problema medico e non tutti i soggetti possono essere adatti per l'analisi delle trappole extracellulari dei macrofagi, o MET (questo dovrà essere determinato per ogni singolo progetto).
- Prendere la soluzione BAL e centrifugarla (500 x g per 10 minuti) per formare un pellet, lavare due volte con terreno di coltura (Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) con il 5% di siero fetale di vitello e l'1% di L-glutammina) a temperatura ambiente, quindi diluire le cellule in 4 mL di terreno di coltura.
- Se necessario, richiedere un conteggio differenziale formale; la maggior parte delle cellule (generalmente >80%) saranno macrofagi><.
nota: Questo sarà generalmente eseguito da un servizio di istologia clinica utilizzando l'aspetto morfologico dei diversi tipi di cellule.
- Eseguire una conta delle cellule macrofagiche vitali sulla soluzione BAL utilizzando l'esclusione del blu di tripano e un emocitometro.
nota: La soluzione di BAL è ottenuta dall'uomo e dai topi, come menzionato nel passaggio 1.1.
- Aggiungere 1 - 4 x 105 macrofagi a piastre da 24 pozzetti su vetrini coprioggetti in 500 μL di terreno di coltura per pozzetto e lasciare riposare per una notte a 37°C; le cellule aderiranno ai vetrini. Per i campioni umani, aggiungere antibiotici (ad es. penicillina e streptomicina, 104 U/mL) per prevenire la contaminazione batterica.
2. Marcatura in immunofluorescenza/microscopia dei macrofagi BAL
NOTA: Le celle sono aderenti ai vetrini coprioggetti come menzionato sopra.
- Rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Fissare le cellule nel fissativo paraformaldeide/periodato/lisina (PLP) al 2% per 10 min.
- Lavare brevemente le celle in PBS, quindi permeabilizzare allo 0,2% Tween 20 in PBS per 20 minuti.
- Bloccare le cellule con il 10% di siero di pollo in albumina sierica bovina (BSA) al 5% diluita in PBS per 30 minuti.
- Incubare con anticorpi primari e di controllo dell'isotipo per 1 ora a temperatura ambiente a concentrazioni di 1:100 (dettagli più specifici sono riportati nella Tabella dei materiali) a 37 °C.
nota: Per i campioni di BAL, di solito non è richiesto un marcatore specifico dei macrofagi.
- Dopo l'aggiunta degli anticorpi primari, lavare le cellule in PBS e incubare ulteriormente con gli anticorpi secondari corrispondenti per 40 minuti a temperatura ambiente.
- Lavare le sezioni in PBS e montarle con un mezzo di montaggio basato su DAPI per la visualizzazione utilizzando un microscopio confocale (come menzionato sopra) a eccitazioni laser 405, 488, 561 e 647 nm e un obiettivo a olio 40X, 1.0 NA.