1. Inoculazione spray con una sospensione di M. grisea Conidia
- Coltura fungina per M.grisea
- Preparare il terreno di coltura di farina d'avena per pomodori agar (OTA) per ceppi fungini.
- Pesare 30 - 50 g di farina d'avena, aggiungerla a 800 ml di acqua distillata/deionizzata (ddH2O) e far bollire la miscela per 30 minuti nella pentola elettrica.
- Filtrare il succo di farina d'avena bollito nel bicchiere attraverso un pezzo di garza.
- Aggiungere 150 ml di succo di pomodoro e 20 g di agar agar al filtrato nel becher e aggiungere ddH2O fino a 1.000 ml.
- Preparazione dei materiali sperimentali
- Immergere circa 50 semi di riso (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) in ddH2O per 3 d oppure immergere circa 50 semi di orzo (Hordeum vulgare cv Golden Promise) in ddH2O per circa 1 d.
- Avvolgere i semi di riso o d'orzo in una garza umida e farli germogliare su carta da filtro umida in circa 30 piastre di Petri con un diametro di 10 cm x 10 cm a 28 °C. Il tempo di germinazione dei semi di riso è di circa 2 - 3 giorni e il tempo di germinazione dei semi d'orzo è di circa 2 giorni. L'umidità relativa nella serra è di circa il 70%.
- Piantare le piantine del riso o dell'orzo in vasi utilizzando terriccio autoclavato e annaffiare e poi coprirle con uno strato di vermiculite.
- Metti le piante in una serra adatta o in una cella di crescita a 25 °C per circa 1 ~ 2 settimane.
- Tagliare 3 strati di carta da filtro in cerchi con forbici chirurgiche sterili (ogni cerchio deve avere un diametro di 8 cm) e posizionarli su piastre di plastica sterili da 100 mm.
- Aggiungere ddH2O a ogni piatto per immergere la carta da filtro.
- Assicurati che la carta da filtro sia completamente bagnata ma non aggiungere altra acqua.
- Rimuovere l'acqua in eccesso con una pompa a vuoto.
- Mettere 2 stuzzicadenti sterili nel piatto di coltura per sostenere le foglie di riso/orzo; distanziare gli stuzzicadenti ~2 - 3 cm l'uno dall'altro.
- Raccogli le foglie del riso 2 settimane dopo la semina o prendi le foglie dell'orzo 7 giorni dopo la semina.
- Utilizzando piantine di riso/orzo da 4 a 6 foglie, tagliare la parte inferiore del gambo a ~5 cm dall'alto e raccogliere le foglie.
- Protocollo di inoculazione spray
- Coltivare il ceppo fungino su piastre OTA in un incubatore termostatico (25 °C) per ~4 giorni.
- Aggiungere ~2 mL di ddH2O utilizzando una pipetta da 0,5 - 5 mL a ciascuna piastra di 4 giorni.
- Con un anello di inoculazione, raschiare i miceli del ceppo selvatico M. grisea e del ceppo mutante in detriti di micelio.
- Raccogli i detriti di micelio e trasferiscili su una nuova piastra OTA. Prendi i detriti di micelio e asciugali con il phon sul banco pulito.
- Coprire la piastra con 3 strati di garza per garantire l'umidità necessaria per la crescita dei conidi in serra a 25 °C durante il giorno (14 h) e 23 °C di notte (10 h) per 24 - 48 h.
- Aggiungere 2 ml di ddH2O a ciascun piatto e raschiare delicatamente i conidi con tamponi di cotone sterili seguiti da una filtrazione attraverso 2 strati di carta per lenti. Fare attenzione a non graffiare la superficie del terreno di coltura.
- Trasferire la sospensione di conidi in una nuova provetta da 50 mL con una pipetta da 100 - 1.000 μL.
- Centrifugare per 5 minuti ad una temperatura minima di 5.000 x g a 25 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet per ottenere 2 x 104 conidi per mL in una soluzione di Tween-20 allo 0,025% (v/v). La soluzione Tween-20 è solitamente di circa 10 - 20 ml.
- Versare la sospensione di spore in uno spruzzatore portatile.
- Spruzzare circa 10 mL della sospensione conidiale sulle foglie di riso di piantine di riso di 2 settimane o sulle foglie d'orzo di piantine di orzo di 7 giorni e incubarle a 25 °C in una camera buia e umida per ~24 ore. Spruzzare le piante di controllo con la soluzione Tween-20 allo 0,025% (v/v).
- Trasferire le foglie in un'altra camera umida sotto luce fluorescente a 25 °C per un fotoperiodo di 12 ore.
- Registrare i sintomi della malattia a 5 giorni dopo l'inoculazione. Esamina le lame malate di riso/orzo di ~6 cm di lunghezza. Lo standard di valutazione è conforme al sistema di punteggio per la resistenza alle esplosioni dell'International Rice Research Institute (IRRI). I dettagli del sistema di incisione per la resistenza allo scoppio sono riportati nella Tabella 1.
- Fotografa le foglie per valutare l'infezione dei ceppi testati. L'infezione è stata valutata in base al numero di lesioni per 3,6cm2.
Tabella 1: Un sistema di punteggio per la resistenza all'esplosione. La tabella è citata dall'International Rice Research Institute (IRRI).
| scala | descrizione |
| 1 | Piccoli granelli marroni di dimensioni millimetriche |
| numero arabo | Piccole macchie grigie necrotiche da tondeggianti a leggermente allungate, di circa 1-2 mm di diametro, con un margine marrone distinto. Le lesioni si trovano principalmente sulle foglie superiori |
| 3 | Il tipo di lesione è lo stesso del 2, ma un numero significativo di lesioni si trova sulle foglie superiori |
| 4 | Tipiche lesioni da blasto suscettibili, di 3 mm o più, che infettano meno del 4% dell'area fogliare |
| 5 | Tipiche lesioni da blasto suscettibili, di 3 mm o più, che infettano meno del 4-10% dell'area fogliare |
| 6 | Tipiche lesioni da blasti suscettibili, di 3 mm o più, che infettano meno dell'11-25% dell'area fogliare |
| 7 | Tipiche lesioni da blasto suscettibili, di 3 mm o più, che infettano meno del 26-50% dell'area fogliare |
| 8 | Tipiche lesioni esplosive suscettibili, 3 mm o più, che infettano meno del 51-75% dell'area fogliare, molte foglie morte |
| 9 | Le tipiche lesioni da blasto suscettibili, di 3 mm o più, infettano più del 75% dell'area fogliare |
