1. Coltura fungina per M.grisea
- Preparare il terreno di coltura di farina d'avena per pomodori agar (OTA) per ceppi fungini.
- Pesare 30 - 50 g di farina d'avena, aggiungerla a 800 ml di acqua distillata/deionizzata (ddH2O) e far bollire la miscela per 30 minuti nella pentola elettrica.
- Filtrare il succo di farina d'avena bollito nel bicchiere attraverso un pezzo di garza.
- Aggiungere 150 ml di succo di pomodoro e 20 g di agar agar al filtrato nel becher e aggiungere ddH2O fino a 1.000 ml.
2. Preparazione dei materiali sperimentali
- Immergere circa 50 semi di riso (Oryza sativa) cultivar Lijiangxintuan-heigu (LTH) in ddH2O per 3 d oppure immergere circa 50 semi di orzo (Hordeum vulgare cv Golden Promise) in ddH2O per circa 1 d.
- Avvolgere i semi di riso o d'orzo in una garza umida e farli germogliare su carta da filtro umida in circa 30 piastre di Petri con un diametro di 10 cm x 10 cm a 28 °C. Il tempo di germinazione dei semi di riso è di circa 2 - 3 giorni e il tempo di germinazione dei semi d'orzo è di circa 2 giorni. L'umidità relativa nella serra è di circa il 70%.
- Piantare le piantine del riso o dell'orzo in vasi utilizzando terriccio autoclavato e annaffiare e poi coprirle con uno strato di vermiculite.
- Metti le piante in una serra adatta o in una cella di crescita a 25 °C per circa 1 ~ 2 settimane.
- Tagliare 3 strati di carta da filtro in cerchi con forbici chirurgiche sterili (ogni cerchio deve avere un diametro di 8 cm) e posizionarli su piastre di plastica sterili da 100 mm.
- Aggiungere ddH2O a ogni piatto per immergere la carta da filtro.
- Assicurati che la carta da filtro sia completamente bagnata ma non aggiungere altra acqua.
- Rimuovere l'acqua in eccesso con una pompa a vuoto.
- Mettere 2 stuzzicadenti sterili nel piatto di coltura per sostenere le foglie di riso/orzo; distanziare gli stuzzicadenti ~2 - 3 cm l'uno dall'altro.
- Raccogli le foglie del riso 2 settimane dopo la semina o prendi le foglie dell'orzo 7 giorni dopo la semina.
- Utilizzando piantine di riso/orzo da 4 a 6 foglie, tagliare la parte inferiore del gambo a ~5 cm dall'alto e raccogliere le foglie.
3. Inoculazione di ferite con cubi di micelio o goccioline di sospensione conidiale di M. grisea
- Con l'aiuto di un ago anatomico, raschiare tre ferite lunghe 2 - 3 cm nelle nervature principali delle foglie di riso/orzo staccate; fare attenzione a non penetrare nelle foglie.
- Metti le foglie raschiate sugli stuzzicadenti e spruzza una soluzione di Tween-20 allo 0,02% (v/v) sulle foglie per formare uno strato di goccioline.
- Tagliare un tappo miceliale di 0,5 cm x 0,5 cm per ogni ceppo di M. grisea (wild-type, mutante, ceppi del complemento o altri ceppi di prova) da una piastra OTA.
- Mettere i tappi miceliali o 25 μL di goccioline di sospensione conidiale sulle foglie ferite e incubare le foglie a 25 °C in una camera umida per 3 - 8 giorni.
- Esaminare le lesioni a 5 - 7 giorni dopo l'inoculazione. Il metodo di esame è lo stesso del metodo di inoculazione spray (vedi passaggio 1.3.13).
- Esamina le lame di riso/orzo malate di ~6 cm di lunghezza e fotografale per valutare l'infezione dei ceppi testati. L'infezione è stata valutata in base al numero di lesioni per 3,6cm2.
