1. Produzione di HBV ricombinante che codifica per la proteina reporter
- Preparazione delle cellule HepG2
- Preparare un terreno di coltura cellulare (terreno di Eagle's modificato di Dulbecco o DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina e 100 U/ml di aminoacidi non essenziali).
- Piastra 4 x 106 cellule HepG2 in un piatto rivestito di collagene da 10 cm in 10 ml di terreno di coltura il giorno prima della trasfezione. Incubare le cellule HepG2 a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2.
nota: Quando circa 4 x 106 cellule HepG2 vengono piastrate in un piatto rivestito di collagene di 10 cm in 10 ml di terreno di coltura, saranno confluenti al 70-90% il giorno successivo.
- Trasfezione
- Trasfettare le cellule HepG2 con 5 μg di pUC1.2HBV (virus dell'epatite B) delta epsilon e 5 μg di pUC1.2HBV/NL15 utilizzando un reagente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore.
- Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura e aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco.
- Una settimana dopo la trasfezione, trasferire il terreno di coltura contenente l'HBV ricombinante in una provetta da 50 ml e procedere al passaggio 1.3.1. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura fresco alla piastra contenente le cellule trasfettate.
nota: La produzione dell'HBV ricombinante viene mantenuta per 4 settimane. Il terreno di coltura contenente HBV ricombinante può essere conservato a 4 °C per 1 mese.
- Purificazione dell'HBV ricombinante
- Rimuovere i detriti cellulari dal terreno di coltura contenente HBV ricombinante mediante centrifugazione (2.300 x g per 5 minuti).
- Passare il surnatante attraverso un filtro a membrana da 0,45 μm.
- Aggiungere un volume uguale di 26% di PEG/1,5 M NaCl (polietilenglicole 6000: 130 g, NaCl, 49 g, 1 ml di EDTA 0,5 M (acido etilendiamminotetraacetico) pH 8,0 e 5 ml di 1 M HEPES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico) (pH 7,6 in 500 ml) al terreno di coltura contenente HBV ricombinante e mescolare delicatamente. Incubare per una notte a 4 °C.
- Centrifugare a 2.300 x g per 20 min a 4 °C.
- Eliminare il surnatante e sciogliere il pellet in 0,5 ml di TNE (10 mM Tris (tris(idrossimetil)amminometano), 50 mM di NaCl, 1 mM di EDTA).
- Rimuovere i detriti mediante centrifugazione a 2.300 x g per 5 minuti.
- Caricare 0,5 ml di TNE contenente HBV ricombinante su 0,8 ml di saccarosio al 20% in TNE.
- Centrifugare a 100.000 × g per 3 ore a 15 °C.
- Scartare la maggior parte possibile del surnatante e conservare il pellet. Risospenderlo in 1 ml di DMEM privo di siero per 40 ml di terreno di coltura iniziale.
- Incubare per una notte a 4 °C.
- Filtrare attraverso un filtro da 0,45 μm. Preparare aliquote da 0,5 ml e conservare a -80 °C.
nota: Se si osserva una contaminazione da proteina reporter del campione virale originale, purificare il virus mediante ultracentrifugazione a gradiente di densità del 5-30% di saccarosio in TNE a 100.000 x g per 2 ore o centrifugazione bilanciata con densità CsCl da 1,1-1,6 g/ml a 150.000 x g per 50 ore.
2. Infezione da HBV ricombinante
- Coltura di cellule HepG2 che esprimono stabilmente NTCP (polipeptide co-trasportatore di sodio taurocolato) (HepG2/NTCP) suscettibili all'infezione da HBV in DMEM integrato con il 10% di FBS, 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina, 250 μg/ml di G-418 (geneticina) e 100 U/ml di aminoacidi non essenziali a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2
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- Un giorno prima dell'infezione, preparare circa 5 x 104 cellule HepG2/NTCP in una piastra rivestita di collagene a 96 pozzetti in 0,1 ml di terreno di coltura.
- Scongelare l'HBV ricombinante in un bagno d'acqua a 37 °C fino a quando non rimane un po' di ghiaccio nel flaconcino.
- Preparare il terreno per l'infezione combinando quanto segue: 10 μl di PEG8000 al 40% in 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), 2 μl di dimetilsolfossido (DMSO), 10 μl di HBV ricombinante e 78 μl di terreno di coltura fresco per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
- Aggiungere 100 μl di soluzione ricombinante di HBV a un pozzetto della piastra a 96 pozzetti.
- Un giorno dopo l'infezione, lavare le cellule infette 3 volte con 300 μl di PBS per pozzetto per rimuovere la proteina reporter contaminante dalla frazione virale.
- Incubare le cellule infette in 200 μl di terreno di coltura contenente il 2% di DMSO per una settimana o meno.
3. Analisi
- Una settimana dopo l'infezione, lavare le cellule infette 3 volte con PBS.
- Aggiungere 50 μl di tampone di lisi alle cellule infette.
- Agitare la piastra di coltura per 5 minuti, quindi centrifugare a 2.000 x g per 5 minuti.
- Aggiungere 50 μl del substrato reporter nella piastra del luminometro.
- Aggiungere 20 μl di lisato cellulare a una piastra luminometrica contenente il substrato reporter. Mescolare vorticando brevemente.
- Posiziona la lastra nel luminometro e avvia la lettura.
