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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Anestetizzare, Intubare e Inoculare gli Animali
NOTA: Si raccomandano ratti maschi Sprague-Dawley immunocompetenti privi di patogeni specifici (SPF) del peso di 100 - 120 g. Fornire a tutti gli animali cibo e acqua ad libitum e alloggiarli socialmente su trucioli di legno o altre lettiere assorbenti con cicli standard di luce-buio di 12 ore.
- Prima di condurre qualsiasi esperimento, procurarsi e sterilizzare una cannula metallica e un tubo in polietilene della dimensione appropriata per la specie animale. Ottenere siringhe monouso sterili da 1 ml e aghi monouso sterili da 25 gauge.
cautela: Smaltire sempre queste siringhe e aghi in un contenitore per oggetti taglienti.
- Per i ratti, acquistare o produrre una cannula metallica lunga circa 12 cm, con diametro interno di 0,9 - 1,0 mm e diametro esterno di 1,0 - 1,2 mm e piegata a un angolo di circa 45° a un'estremità. Tagliare una lunghezza compresa tra 11 e 12 pollici di tubo in polietilene con un diametro interno di 0.4 mm e un diametro esterno di 0.8 mm. (Fare riferimento alla Figura 1A.)
- Posizionare la cannula metallica in una provetta di vetro, con tappo a vite, e sterilizzare in autoclave con metodi standard. Immergere e conservare le parti tagliate del tubo di polietilene in un becher coperto contenente alcol.
- Preparare il piano di lavoro e il dispositivo di intubazione.
- Posizionare un tappetino usa e getta pulito sul piano di lavoro, vicino al bagnomaria. Trasferisci la cannula di metallo, nel suo tubo di vetro, su questa superficie. Rimuovere il tappo dal tubo di stoccaggio e far scorrere l'estremità "maniglia" della cannula verso l'estremità aperta del tubo.
- Utilizzando una pinza sterile, rimuovere un pezzo di tubo in polietilene dal becher e inserirlo all'interno della cannula metallica sterile, assicurandosi che si muova liberamente. Inserire un ago sterile monouso calibro 25 (per ratti) sull'estremità libera del tubo in polietilene facendo scorrere l'ago di diversi mm nel tubo. (Fare riferimento alla Figura 1A per ratto).
- Posizionare dei segni guida sia sulla cannula metallica che sul tubo in polietilene per indicare la profondità di inserimento nell'animale seguendo la procedura di intubazione descritta di seguito su un singolo animale sottoposto a eutanasia. Aprire la cavità toracica per l'osservazione, quindi posizionare correttamente la cannula metallica e far avanzare il tubo in polietilene in modo appropriato. Usando una penna indelebile, segna la cannula metallica nel punto in cui incontra la bocca dell'animale e il tubo in polietilene nel punto in cui incontra la parte superiore della cannula metallica per facilitare il corretto posizionamento negli animali rimanenti.
- All'interno di una cappa aspirante (o utilizzando un apposito sistema di evacuazione), anestetizzare fino a 6 animali alla volta in una camera chiusa alimentata con isoflurano al ≤5% in 1,5 L/min di ossigeno fino a quando il riflesso del vomito non viene inibito (circa 1 minuto).
nota: Prima di condurre qualsiasi esperimento, stabilire la dose sicura e il tempo di esposizione dell'isoflurano nelle condizioni specifiche utilizzate (ad esempio dimensioni/tipo di camera e dimensioni/specie/ceppo dell'animale) per prevenire l'esposizione letale involontaria.
- Riempire una siringa sterile monouso da 1 ml (per ratti) con soluzione fisiologica sterile inserendo la punta sterile nella soluzione fisiologica e tirandola indietro sullo stantuffo. Collegare la siringa all'ago inserito nel tubo in polietilene e sciacquare l'intero volume di soluzione fisiologica attraverso il tubo fino a svuotare la siringa.
- Riempire la siringa con l'inoculo a base di agar dal contenitore nel bagnomaria e sciacquare l'agar attraverso il tubo fino a quando il tubo non è innescato (ad es. completamente riempito con l'agar).
- Per i ratti, rimuovere l'ago calibro 25 (montato sul tubo in polietilene) dalla siringa monouso. Gettare la siringa usata in un contenitore per oggetti taglienti. Riempire una nuova siringa sterile monouso da 1 ml con l'inoculo a base di agar dal contenitore nel bagnomaria, inserendo la punta sterile nell'inoculo e tirando indietro lo stantuffo. Riattaccare l'ago (montato sul tubo in polietilene) e far scorrere l'agar attraverso il tubo premendo lo stantuffo fino a quando il tubo non è completamente riempito di agar.
- Rimuovere un animale dalla camera di anestesia. Posizionare l'animale in posizione supina sul tappetino monouso con la testa a destra e la coda a sinistra come mostrato nella Figura 1C.
- Utilizzando il dispositivo di intubazione (cioè la cannula metallica dotata di tubo in polietilene), intubare l'animale e inserire la cannula nel grande lobo del polmone sinistro (vedere Figura 1D).
- Inserire l'estremità libera della cannula metallica nella bocca dell'animale. Ruotare la cannula in modo che l'estremità libera sia angolata verso l'alto e farla avanzare delicatamente nella trachea, bypassando accuratamente le strutture laringee con un leggero movimento rotatorio. Confermare l'inserimento nella trachea anziché nell'esofago facendo scorrere delicatamente la cannula leggermente in avanti e indietro più volte mentre si palpano gli anelli tracheali con l'indice sinistro come mostrato nella Figura 1C.
- Quando la cannula raggiunge la biforcazione in cui la trachea si divide nei bronchi sinistro e destro, fare un leggero movimento di torsione verso il lato sinistro dell'animale per assicurarsi che la cannula sia inserita nel bronco sinistro. Far avanzare la cannula metallica fino a metà strada a tre quarti del polmone sinistro, utilizzando il segno guida precedentemente posizionato per confermare che è stata raggiunta la profondità appropriata.
- Con la cannula metallica in posizione, far avanzare il tubo di polietilene di diversi mm. Utilizzare il segno guida precedentemente posizionato sul tubo per assicurarsi che sia avanzato solo quanto basta per uscire dall'estremità della cannula metallica e non perforare il polmone.
- Con entrambe le cannule in posizione, utilizzare la siringa in dotazione per instillare 100 μl (per i ratti) della sospensione di agar in profondità nel grande lobo del polmone sinistro (vedere Figura 1D). Estrarre diversi mm di tubo in polietilene, quindi rimuovere delicatamente il dispositivo di intubazione intatto. Rimettilo nel tubo di vetro e sposta l'animale in una gabbia fresca per riprenderlo.
