Incannulamento del dotto linfatico mesenterico in un modello di ratto per raccogliere il fluido linfatico

Abstract

Fonte: Trevaskis, N. L., et al. Il modello di ratto cannulato del dotto linfatico mesenterico: applicazione alla valutazione del trasporto linfatico intestinale dei farmaci. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra una tecnica per incannulare il dotto linfatico mesenterico nei ratti. Questo metodo consente l'accesso diretto all'intero volume di componenti presenti nel fluido linfatico.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Incannulamento del dotto linfatico mesenterico

1. Posizionare l'animale con il lato destro rivolto verso l'operatore. Eseguire l'intervento chirurgico con o senza l'assistenza di un microscopio operatorio, a seconda delle esigenze.
2. Aprire lo strato superiore della parete muscolare addominale con un'incisione diritta di 4 cm che si estende dalla linea mediana (processo xifoideo) al fianco destro circa 2 cm sotto la gabbia toracica (margine costale) utilizzando una lama di bisturi sterile (vedi Figura 1B).
3. Aprire gli strati rimanenti della parete muscolare addominale da 4 - 5 mm lateralmente alla linea mediana al fianco destro con un piccolo paio di forbici chirurgiche (vedi Figura 1B).
4. Ritrarre l'intestino tenue sotto la parete muscolare addominale sinistra e tenerlo in posizione utilizzando 2 - 3 pezzi di garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica.
5. Collegare il ratto su una siringa di plastica da 10 ml posizionata orizzontalmente sotto la schiena del ratto a livello del rene destro per facilitare la visualizzazione del dotto linfatico mesenterico.
6. Localizzare il dotto linfatico mesenterico superiore: un vaso di circa 0,5 - 1 mm di diametro che è perpendicolare al rene destro e immediatamente rostrale e parallelo all'arteria mesenterica (un vaso sanguigno pulsante rosso scuro; vedi Figura 1C).
   NOTA: Nei ratti non a digiuno o predosati con olio il recipiente è bianco, opaco e più facile da visualizzare rispetto ai ratti a digiuno in cui è abbastanza traslucido.
7. Ispezionare l'area immediatamente caudale al grande dotto linfatico mesenterico superiore e all'arteria mesenterica per determinare se è presente un secondo dotto linfatico accessorio più piccolo. Se presente, bloccare il flusso di linfa attraverso il dotto recidendo il dotto e occludendolo con supercolla, o legando una sutura attorno al dotto, per garantire che l'intero volume di linfa che scorre dall'intestino venga raccolto dal dotto linfatico mesenterico superiore.
8. Far passare un paio di pinze diritte attraverso il letto adiposo peri-renale al margine inferiore del rene destro e attraverso gli strati di tessuto connettivo immediatamente sotto la vena cava, in una direzione parallela al dotto linfatico mesenterico superiore.
9. Usando la punta della pinza afferrare la cannula linfatica e tirarla attraverso il letto adiposo peri-renale con un'estremità immediatamente adiacente al dotto linfatico mesenterico e l'altra esternalizzata dall'animale a livello del rene destro.
10. Isolare il dotto linfatico mesenterico dagli strati sovrastanti di tessuto connettivo e adiposo mediante dissezione smussata. Fare attenzione a non perforare o danneggiare il dotto linfatico.
11. Dopo aver isolato il dotto linfatico, fai un piccolo foro nel dotto linfatico con le microforbici, la punta affilata della pinza del gioielliere o un ago da 25 G. Fare attenzione a non recidere completamente il recipiente.
12. Assicurarsi che la cannula linfatica sia completamente riempita con una soluzione anticoagulante (utilizzando una siringa e un ago da 25 G) senza vuoti d'aria. Inserire la cannula linfatica di circa 2 - 4 mm all'interno del dotto linfatico mesenterico attraverso il piccolo foro con l'aiuto di un piccolo paio di pinze.
13. Osservare la cannula linfatica per un paio di minuti. Osservare un flusso graduale di linfa intestinale dall'estremità di raccolta libera della cannula se l'incannulamento ha successo. Se l'incannulamento non riesce, ripetere i passaggi 1.8 - 1.12.
14. Se l'incannulamento ha esito positivo, fissare la cannula posizionando una piccola goccia di adesivo veterinario sul foro di ingresso nel dotto linfatico. Fare attenzione a non occludere il vaso attraverso l'applicazione di adesivo veterinario in eccesso.
15. In attesa che l'adesivo veterinario si fissi, osservare il flusso di linfa per diversi minuti per assicurarsi che la procedura di incannulamento sia andata a buon fine. Una volta certi della riuscita dell'incannulamento, rimuovere con cura i pezzi di garza che sono stati inseriti nella cavità addominale e posizionare l'intestino tenue nella sua posizione originale.
16. Pre-pesare le provette per la raccolta della linfa, etichettare le provette per la raccolta di campioni di linfa e sangue e aggiungere una soluzione anticoagulante. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione anticoagulante per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/ml di EDTA in acqua sterile o di 10 - 20 UI/ml di eparina nella linfa o nel sangue raccolti.
17. Posizionare una provetta per la raccolta della linfa contenente un anticoagulante (passaggio 1.16) all'estremità della cannula per raccogliere la linfa che scorre liberamente.
18. Successivamente, incannulare il duodeno per l'infusione di soluzioni e/o formulazioni reidratanti.

Risultati

Figura 1. Fotografie di (A) l'addome rasato in preparazione per incannulare il dotto linfatico, (B) la parete muscolare addominale aperta con un'incisione diritta di 4 cm che si estende dalla linea mediana al fianco destro per accedere al dotto linfatico e (C) il dotto linfatico mesenterico superiore (in cerchio giallo) perpendicolare al rene destro.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina sterile	Baxter sanità	AHB 1307	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui sono le sacche saline Baxter da 100 ml, scatola da 50
70 % di etanolo nell'acqua	qualunque		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Soluzione di clorexidina gluconato (Microshield 4)	Livingstone Internazionale	JJ60243L	Qualsiasi marca può essere utilizzata. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&ricerca =JJ60243L
Soluzione di betadina	Livingstone Internazionale	BU0510	Qualsiasi marca può essere utilizzata. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&ricerca =BU0510
Ilium Ketamil (Ketamina 100 mg/ ml)	PROVET VICTORIA	KETA I 1	http://www.provet.vom.au
Eparina (35000U.I. in 35 mL	SigmaPharmaceuticals	Codice 337220	http://www.sigmaco.com.au
Cannula in polietilene (PE) d.e. 0,96 mm x d/i.d. 0,58 mm	Prolunghe per microtubi	PE8050	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è il tubo in PE 0,96 x0,58 mm, 30 m
Cannula in polietilene (PE) d.o. 0,8 mm x diametro interno 0,5 mm	Prolunghe per microtubi	PE9658	È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio è un tubo in PE 0,8 x0,5 mm, 30 m
Marcatori	qualunque		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Adesivo veterinario	qualunque		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Ferri calibro 23	Livingstone Internazionale	DN23GX0,75LV	È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio è l'ago monouso Livingstone, sterile, 23GX0,75 pollici, 100/BOX. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT= 6&ricerca=DN23GX0.75LV
Ferri da 25 gauge	Livingstone Internazionale	DN25GX1.0LV	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è l'ago usa e getta Livingstone, sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&ricerca= DN25GX1.0LV
Siringa da 1 ml	Livingstone Internazionale	T3SS01TA	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è la siringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&ricerca =T3SS01TA
Siringa da 10 ml	Livingstone Internazionale	T3SS10SA	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è la siringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&ricerca =T3SS10SA
Tamponi di garza	Livingstone Internazionale	GSC075	Qualsiasi marca può essere utilizzata e tagliata alla dimensione richiesta. Esempio qui è la garza tampone di cotone riempito 7,5x7,5 cm, 8 strati. http:// www.livingstone.com.au/? PG=search_result&CAT=6&ricerca =GSC075
termoforo	Ratek	WT1	È possibile utilizzare qualsiasi marca che mantenga la temperatura a 37°C. Un esempio qui è il vassoio scaldavivande Ratek.
Microscopio operatorio	Zeiss	Numero 495005-0014-000	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Ne è un esempio lo Stereomicroscopio Zeiss Stemi 2000-C con Stand S Double Spot e KL 300 LED. https:// www.micro-shop.zeiss.com/? l=en&p=us&f=e&i=10143
1 x Piccole forbici chirurgiche	Strumenti per la scienza fine (FST)	Codice 14060-09	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui sono le forbici fini FST, 9 cm con tagliente da 21 mm, affilate, dritte. http://www.finescience.ca/ Pagine speciali/Products.aspx? ProductId=40&CategoryId=17
2 x Pinze con punta curva seghettata	Strumenti per la scienza fine (FST)	Codice 11001-13	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è una pinza FST da 13 cm con punta curva da 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/ Pagine speciali/Products.aspx? ProductId=405&CategoryId=32