Incannulamento intraduodenale in un modello di ratto per studi di immunopatologia

Abstract

Fonte: Trevaskis, N. L. et al., Il modello di ratto cannulato del dotto linfatico mesenterico: applicazione alla valutazione del trasporto linfatico intestinale di farmaci.J. Vis. Exp.(2015)

Questo video mostra l'incannulamento intraduodenale in un modello di ratto. Dopo aver anestetizzato il ratto, si localizza il duodeno e si crea una piccola puntura. Una cannula a forma di J con una punta smussata viene inserita e fissata con cura e l'incisione viene chiusa. Il modello di ratto cannulato consente l'infusione intra-intestinale per studi di immunopatologia.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.

1. Preparativi il giorno prima dell'intervento chirurgico

1. Digiunare il ratto la notte prima dell'intervento chirurgico, se necessario. Assicurati che il topo abbia libero accesso all'acqua.
2. Preparare le soluzioni da somministrare al ratto.
   1. Preparare una soluzione reidratante come soluzione salina sterile o soluzione Ringers.
   2. Preparare le soluzioni anestetiche secondo necessità. L'anestetico utilizzato negli esperimenti qui descritti consisteva nel "Cocktail 1" preparato combinando 1,9 ml di ketamina 100 mg/ml, 0,5 ml di xilazina 100 mg/ml, 0,2 ml di acepromazina 10 mg/ml e 2,5 ml di soluzione salina e "Cocktail 2" costituito da 1 ml di ketamina 100 mg/ml e 0,1 ml di acepromazina 10 mg/ml. NOTA: L'isoflurano o il sevoflurano per via inalatoria possono essere preferiti in quanto possono fornire un piano chirurgico di anestesia per un periodo di tempo più lungo.
3. Preparare una soluzione anticoagulante contenente 10 mg/ml di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in acqua sterile o 10 UI/ml di eparina in soluzione fisiologica per lavare la cannula linfatica. Inoltre, preparare una soluzione anticoagulante contenente 2,5 - 10 UI/ml di eparina in soluzione fisiologica per lavare la cannula dell'arteria carotide.
4. Preparare la cannula in polietilene per l'inserimento nel duodeno (0,96 mm O.D, 0,58 mm I.D.)
   1. Tagliare la cannula alla lunghezza richiesta (in genere 25 - 30 cm per la cannula duodenale) e posizionare uno smusso sulla punta della cannula utilizzando una lama chirurgica sterile (vedere Figura 1).
      nota: Ciò aumenta la facilità di inserimento della cannula e riduce l'incidenza del blocco della cannula dopo l'inserimento.
   2. Posizionare un punto di ancoraggio a forma di J nella cannula intraduodenale avvolgendo una piccola parte della cannula su se stessa, riscaldandola con un accendino o una piastra calda e quindi tagliandola a misura (vedere la Figura 1).
5. Collegare la cannula linfatica a un ago da 25 G e a una siringa contenente una soluzione anticoagulante (preparata al punto 1.3). Riempire la cannula linfatica con la soluzione anticoagulante e lasciare la soluzione nella cannula durante la notte (O/N) per ridurre l'incidenza della formazione di coaguli nella cannula linfatica durante la raccolta della linfa.
6. Preparare le provette per la raccolta di campioni di linfa e sangue. Pre-pesare le provette per la raccolta della linfa, etichettare le provette per la raccolta di campioni di linfa e sangue e aggiungere una soluzione anticoagulante. Aggiungere una quantità sufficiente di soluzione anticoagulante per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg/ml di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in acqua sterile o di 10 - 20 UI/ml di eparina nella linfa o nel sangue raccolti.

2. Preparativi immediatamente prima di iniziare la procedura chirurgica

1. Controllare le cannule sciacquandole con soluzione fisiologica sterile o anticoagulante per assicurarsi che siano pervie.
2. Preparare il ratto per la procedura chirurgica.
   1. Anestetizzare il ratto durante l'intervento chirurgico e il periodo di raccolta del campione.
      1. Ad esempio, iniziare l'anestesia tramite iniezione sottocutanea di 1,5 ml/kg di Cocktail I (dal passaggio 1.2.2) in una piega cutanea nella parte posteriore del collo del ratto utilizzando una siringa da 1 ml collegata a un ago da 25 G. Mantenere l'anestesia tramite iniezione intraperitoneale di 0,44 ml/kg di Cocktail 2 (dal passaggio 1.2.2) circa ogni ora secondo necessità, utilizzando una siringa da 1 ml collegata a un ago da 25 G.
      2. Prima di iniziare l'intervento chirurgico, assicurarsi che la profondità dell'anestesia sia sufficiente osservando la frequenza respiratoria, il movimento dei baffi, il tono muscolare e le risposte a stimoli come il pizzicamento del piede. Somministrare ulteriore anestesia secondo necessità.
   2. Radere il pelo dalle regioni chirurgiche, che includono il lato destro dell'addome, per l'incannulamento del duodeno.
   3. Pulire le regioni chirurgiche in modo asettico utilizzando una soluzione di iodio povidone o una soluzione di clorexidina e uno scrub con etanolo al 70%. Ripetere l'operazione 3 volte per ogni regione, terminando con una pulizia finale con etanolo al 70%.
3. Posizionare l'animale in decubito dorsale su un lenzuolo pulito sopra un tampone chirurgico riscaldato (37 °C).

3. Incannulamento del duodeno

1. Posizionare l'animale con il lato destro rivolto verso l'operatore. Eseguire l'intervento chirurgico con o senza l'assistenza di un microscopio operatorio, a seconda delle esigenze.
2. Aprire lo strato superiore della parete muscolare addominale con un'incisione diritta di 4 cm che si estende dalla linea mediana (processo xifoideo) al fianco destro circa 2 cm sotto la gabbia toracica (margine costale) utilizzando una lama di bisturi sterile (vedi Figura 2B).
3. Aprire gli strati rimanenti della parete muscolare addominale da 4 - 5 mm lateralmente alla linea mediana al fianco destro con un piccolo paio di forbici chirurgiche (vedi Figura 2B).
4. Ritrarre l'intestino tenue sotto la parete muscolare addominale sinistra e tenerlo in posizione utilizzando 2 - 3 pezzi di garza sterile imbevuta di soluzione fisiologica.
5. Collegare la cannula del duodeno a una siringa (ad es. 10 ml) riempita con la soluzione reidratante.
6. Identifica il duodeno come la sezione rosa brillante (con più vasi sanguigni) dell'intestino tenue, che dopo una leggera trazione verso il basso rivela lo stomaco.
7. Praticare un piccolo foro nel duodeno a circa 2 cm sotto la giunzione dello stomaco e del duodeno (il piloro) utilizzando un ago sterile da 23 G.
8. Inserire l'estremità uncinata a forma di J della cannula duodenale attraverso il foro di puntura. Fissare in posizione con una goccia di colla cianoacrilica.
9. Iniziare l'idratazione del ratto collegando la cannula alla siringa di reidratazione caricata in una pompa per infusione. Secondo la letteratura, i tassi di reidratazione variano da 0,5 a 3 ml/ora.
10. Dopo aver completato l'incannulamento della linfa e del duodeno, chiudere l'incisione nella parete del muscolo addominale con punti di sutura. Quindi chiudere l'incisione cutanea applicando alcune gocce di adesivo tissutale (cianoacrilato) lungo il lato dell'incisione e pizzicando insieme la pelle su entrambi i lati dell'incisione.

Risultati

Figura 1. Rappresentazione schematica della forma della punta smussata di un'arteria carotide o di una cannula linfatica e della punta smussata a forma di J di una cannula duodenale.

Figura 2. Fotografie di (A) l'addome rasato in preparazione per incan...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione salina sterile	Baxter sanità	AHB 1307	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui sono le sacche saline Baxter da 100 ml, scatola da 50
70 % di etanolo nell'acqua	qualunque		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Soluzione di clorexidina gluconato (Microshield 4)	Livingstone Internazionale	JJ60243L	È possibile utilizzare qualsiasi marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
Soluzione di betadina	Livingstone Internazionale	BU0510	È possibile utilizzare qualsiasi marca. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search
Ilium Ketamil (Ketamina 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	KETA I 1	http://www.provet.com.au/
Ilio Xilazile (Xilazina 100 mg/ml)	PROVET VICTORIA	TRO-3828	http://www.provet.com.au/
ACP 10 Iniezione (Acepromazina 10 mg/ml)	PROVET VICTORIA	VTG-DACP010020	http://www.provet.com.au/
Eparina (35000U.I. in 35 mL)	Sigma Pharmaceuticals	Codice 337220	http://sigmaco.com.au/
Sale disodico diidrato dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	E 1644	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Un esempio qui è il sale disodico di EDTA di Sigma.
Cannula in polietilene (PE) d.e. 0,96 mm x d/i.d. 0,58 mm	Prolunghe per microtubi	PE8050	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è il tubo in PE 0,8x0,5 mm, 30 m
Cannula in polietilene (PE) d.e. 0,8 mm x d.i. 0,5 mm	Prolunghe per microtubi	PE9658	È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio è un tubo in PE 0,96x0,58 mm, 30 m
righello	qualunque		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Marcatori	qualunque		È possibile utilizzare qualsiasi marca
accendino	qualunque		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Colla cianoacrilica	qualunque		È possibile utilizzare qualsiasi marca
Ferri calibro 23	Livingstone Internazionale	DN23GX0,75LV	È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio è l'ago monouso Livingstone, sterile, 23GX0,75 pollici, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN23GX0,75LV
Ferri da 25 gauge	Livingstone Internazionale	DN25GX1.0LV	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è l'ago usa e getta Livingstone, sterile, 25GX1.0inch, 100/BOX. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DN25GX1,0LV
Siringa da 1 ml	Livingstone Internazionale	T3SS01TA	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è la siringa Terumo 1 ml Slip Tuberculin 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS01TA
Siringa da 10 ml	Livingstone Internazionale	T3SS10SA	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è la siringa Terumo 10 ml Slip 100/Box. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =T3SS10SA
Tamponi di garza	Livingstone Internazionale	GSC075	Qualsiasi marca può essere utilizzata e tagliata alla dimensione richiesta. Esempio qui è la garza tampone di cotone riempito 7,5x7,5 cm, 8 strati. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =GSC075
termoforo	Ratek	WT1	È possibile utilizzare qualsiasi marca che mantenga la temperatura a 37°C. Un esempio qui è il vassoio scaldavivande Ratek.
Lampada scialitica	Apparato di Harvard	72-0215 con 72-0267	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è l'apparecchio Harvard V-Lux 1000 Sorgente di luce fredda con guida di luce a collo d'oca biforcato, nero, diametro della fibra di 4,7 mm (ciascun braccio). http://www.harvardapparatus.com/webapp/wcs/stores/servlet/product_11051_10001_50601_
Microscopio operatorio	Zeiss	Numero 495005-0014-000	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Ne è un esempio lo Stereomicroscopio Zeiss Stemi 2000-C con Stand S Double Spot e KL 300 LED. https://www.micro-shop.zeiss.com/?l=en&p=us&f=e&i=10143
Sutura in seta	Livingstone Internazionale	DTSK163019F4	È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio qui è * Invia questo articolo via email al mio amico Sutura di seta a taglio inverso a 3/8 cerchi 3/0 filo 19mm. http://www.livingstone.com.au/?PG=search_result&CAT=6&search =DTSK163019F4
Lame per bisturi	Strumenti per la scienza fine (FST)	Codice 10020-00	È possibile utilizzare qualsiasi marca. L'esempio qui è la lama per bisturi FST #20. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=191
Manico del bisturi	Strumenti per la scienza fine (FST)	Codice 10004-13	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è FST Scalpel Handle #4. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=298&CategoryId=51
1 x Piccole forbici chirurgiche	Strumenti per la scienza fine (FST)	Codice 14060-09	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui sono le forbici fini FST, 9 cm con tagliente da 21 mm, affilate, dritte. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=40&CategoryId=17
2 x Pinze con punta curva seghettata	Strumenti per la scienza fine (FST)	Codice 11001-13	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è una pinza FST da 13 cm con punta curva da 2,8x1,4 mm. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=405&CategoryId=32
2 x Emostatici	Strumenti per la scienza fine (FST)	Codice 13010-12	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Non tutti gli operatori utilizzano gli emostatici. Esempio qui sono gli emostatici per microzanzare FST da 12 cm con 20 mm di lunghezza x 1,3 mm di larghezza seghettata, punta dritta. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=377&CategoryId=33
1 x supporto per ago da sutura	Strumenti per la scienza fine (FST)	Codice: 12001-13	È possibile utilizzare qualsiasi marca. Esempio qui è il porta-aghi Hasley FST da 13 cm con punta da 16 mm di lunghezza x 1,9 mm di larghezza. http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=254&CategoryId=70