Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione dell'estratto della ghiandola lacrimale
NOTA: I ratti sono stati anestetizzati con l'iniezione intraperitoneale di ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). La corretta anestesia è stata confermata dal pizzicamento delle dita dei piedi e della coda. Il gel oftalmico è stato applicato sugli occhi del ratto per prevenire la secchezza dopo ogni procedura. I ratti anestetizzati sono stati posti sotto luci a infrarossi lontani per mantenere gli animali al caldo fino a quando non si sono completamente ripresi. Durante le procedure e il tempo di recupero, gli animali sono stati attentamente monitorati dai ricercatori. Tutti i materiali e gli strumenti chirurgici erano sterili prima dell'uso. Alla fine dell'esperimento, i ratti sono stati soppressi mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital (80 mg/kg). L'eutanasia completa è stata verificata dalla mancanza di polso cardiaco e dall'assenza di riflesso del battito di ciglia toccando il bulbo oculare. I ratti sono stati alloggiati in condizioni standard: temperatura ambiente, 21-23 °C; umidità relativa, 30-70%; ciclo luce-buio, alternato 12 h (dalle 7 alle 19).
- Posiziona le femmine di ratto Sprague-Dawley sottoposte a eutanasia (fascia di età da 8 settimane a 16 settimane) in piano, con un orecchio contro il tavolo e l'altro rivolto verso l'alto. Praticare un'incisione di 10 mm superiormente-inferiormente sotto l'orecchio esposto con un paio di forbici a molla. Rimuovere la ghiandola lacrimale sezionandola dal tessuto connettivo circostante e dal condotto di drenaggio.
- Conservare i pressacavi a -80 °C fino al momento del bisogno. Scongelare le ghiandole sul ghiaccio. Tritare il più finemente possibile sul ghiaccio con le forbici. Aggiungere 150 μl di PBS con 1x inibitore della proteasi per ghiandola lacrimale.
- Sonicare i campioni sul ghiaccio per 5 minuti a 20 kHz con il sonicatore impostato su 10 s on e 10 s off al 30% di ampiezza. Centrifugare i campioni sonicati per 20 minuti a 13.000 x g e 4 °C.
- Pipettare il surnatante e trasferirlo in una nuova provetta. Aliquotare il surnatante in provette da 1,5 mL e conservarle a -80 °C. Misurare la concentrazione proteica con un test dell'acido bicinconinnico, secondo le istruzioni del produttore.
2. Preparazione dell'emulsione e della tossina pertosse
- emulsione
- Aggiungere 40 mg di Mycobacterium tuberculosis H37Ra ucciso a caldo in 10 mL di adiuvante completo di Freund contenente 1 mg/mL di Mycobacterium tuberculosis H37Ra e mescolare bene.
nota: L'adiuvante completo finale di Freund contiene 5 mg/mL di Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Pesare l'ovoalbumina, scioglierla in PBS e preparare una miscela di antigeni contenente 2 mg/mL di ovoalbumina e 10 mg/mL di estratto di ghiandola lacrimale. Con l'obiettivo di ottenere un volume di iniezione di 200 μl per ogni animale, preparare una miscela master basata sul numero di animali.
- Trasferire l'adiuvante di Freund incompleto o l'adiuvante di Freund completo in una provetta da 50 mL, assicurandosi che il volume dell'adiuvante della miscela di antigeni sia in un rapporto 1:1. Aggiungere la miscela di antigene goccia a goccia all'adiuvante mentre si agita con la massima velocità in modo da non provocare fuoriuscite. Continuare a vorticare per 5 minuti dopo che tutto l'antigene è stato aggiunto.
- Trasferire l'emulsione in una siringa da 5 ml e collegarla con un'altra siringa da 5 ml attraverso un connettore per siringa. Spingere l'emulsione da una siringa all'altra per mescolarla.
nota: L'emulsione è pronta se una singola goccia rimane come una sfera quando viene posta in acqua. Utilizzare solo emulsione preparata al momento o conservata per una notte a 4 °C.
- Tossina della pertosse
- Ricostituire 50 μg di tossina pertosse in 500 μL di acqua per ottenere una concentrazione finale di 100 ng/μL. Votare il contenitore per 30 secondi per assicurarsi che la tossina si dissolva completamente.
nota: Non sterilizzare mediante filtrazione, poiché ciò comporterebbe una perdita di materiale. Non congelare. Questa soluzione rimane attiva per almeno 6 mesi a 4 °C.
- Diluire 100 ng/μL di tossina della pertosse a 3 ng/μL utilizzando PBS. Trasferire 100 μl della tossina della pertosse diluita in una siringa per iniezione Luer-lock da 1 mL con un ago da 27 G.
3. Immunizzazione dei ratti di Lewis
- Il giorno 0, mescolare l'emulsione un paio di volte. Distribuire 200 μL dell'emulsione, che contiene 1 mg di estratto di ghiandola lacrimale e 200 μg di ovoalbumina in adiuvante completo di Freund, in siringhe Luer-lock da 1 ml con aghi da 27 G. Iniettare l'emulsione per via sottocutanea alla base delle code di topo senza anestesia.
nota: La coda non ha bisogno di essere preriscaldata prima dell'iniezione. Ogni ratto è immunizzato con 1 mg di estratto di ghiandola lacrimale e 200 μg di ovoalbumina in adiuvante di Freund completo con 500 μg di Mycobacterium tuberculosis H37Ra.
- Il giorno 14, iniettare 200 μL dell'emulsione, che contiene 1 mg di estratto della ghiandola lacrimale e 200 μg di ovoalbumina nell'adiuvante di Freund incompleto, allo stesso modo del giorno 0. Iniettare 300 ng di tossina della pertosse in 100 μL di PBS per via intraperitoneale per ratto lo stesso giorno.
4. Iniezione della miscela di antigene nella sottocongiuntiva formicale e nella ghiandola lacrimale per reclutare cellule immunitarie antigene-specifiche e causare infiammazione locale
- Calcola la quantità di ovoalbumina ed estratto della ghiandola lacrimale in base al numero di ratti nell'esperimento. Pesare la quantità necessaria di ovoalbumina e combinarla con l'estratto di ghiandola lacrimale scongelato preparato nella fase 1, ottenendo una soluzione antigenica contenente 1 mg/mL di ovoalbumina e 1 mg/mL di estratto di ghiandola lacrimale.
- Anestetizzare i ratti con ketamina (75 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale. Pizzicare le dita dei piedi dei ratti per assicurarsi che sia stata raggiunta un'anestesia adeguata (cioè, non si osserva alcun movimento reattivo dopo il pizzicamento). Iniettare 5 μL di antigene nella sottocongiuntiva fornicale-dell'occhio. Iniettare 20 μL di antigene nella ghiandola lacrimale.
