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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Encefalomielite autoimmune sperimentale o modello EAE
- Introduzione del modello EAE
- Utilizzare topi femmina 129S4/SvJae×C57BL/6 di età compresa tra 10 e 13 settimane per l'induzione dell'EAE.
- Somministrare ai topi un'iniezione sottocutanea, nella parte superiore e inferiore della schiena, del peptide encefalitogeno MOG35 - 55 (glicoproteina degli oligodendrociti della mielina) (200 μg), emulsionato in 200 μl di adiuvante completo di Freund (CFA) contenente 400 μg di Mycobacterium tuberculosis.
nota: Come controllo sham negativo, non induttore di malattia, può essere utilizzato l'adiuvante di Freund incompleto contenente Mycobacterium tuberculosis, nello stesso volume e per la stessa via.
- Successivamente, e di nuovo 24 ore dopo, somministrare ai topi un'iniezione intraperitoneale di tossina della pertosse (in totale 0,2 μg, diluita in 200 μl di soluzione salina tamponata con fosfato, PBS). Utilizzare topi non trattati come gruppo di controllo, per poter confrontare gli animali malati con quelli sani.
nota: È anche possibile indurre EAE con 200 - 300 μg di peptide MOG35 - 55, 300 - 500 μg di Mycobacterium tuberculosis nel CFA e 0,2 - 0,3 μg di tossina pertosse in un volume di 0,1 - 0,2 ml per iniezione.
- A partire da una settimana dopo l'iniezione, esaminare quotidianamente i topi per i sintomi clinici (vedere passaggio 1.2.1)
nota: Il giorno di insorgenza della malattia varia nei diversi esperimenti, ma nelle condizioni del nostro laboratorio, questo è intorno al giorno 11 e quindi, qui il giorno 14 è definito come 3 giorni dopo l'insorgenza della malattia. Tutti i topi nel presente studio hanno sviluppato sintomi clinici.
2. Punteggio dei topi
- Classificare i sintomi clinici in base ai punteggi clinici come segue: 0) nessun segno, 0,5) paralisi distale della coda, 1) paralisi completa della coda, 1,5) coda floscia e lieve debolezza delle zampe posteriori, 2) coda floscia e grave debolezza delle zampe posteriori, 2,5) coda floscia e paralisi di una zampa posteriore, 3) coda floscia e paralisi di entrambe le zampe posteriori, 3.5) paralisi di entrambi gli arti posteriori e debolezza di un arto anteriore (i topi che hanno raggiunto questo punteggio sono stati soppressi, in linea con le linee guida etiche locali).