Imaging in tempo reale della fagocitosi macrofagica dei globuli rossi opsonizzati IgG

Abstract

Fonte: Horsthemke, M., et al. Imaging 3D time-lapse della fagocitosi da parte di macrofagi di topo. J. Vis. Exp. (2018)

Questo video mostra un test per monitorare gli eventi di fagocitosi dei globuli rossi (RBC) mediati da macrofagi indipendenti. I globuli rossi umani opsonizzati con immunoglobuline G (IgG) di topo vengono incubati con macrofagi di topo e osservati al microscopio confocale. I globuli rossi sono inghiottiti dai macrofagi attraverso la formazione di una coppa fagocitaria e mirati alla degradazione lisosomiale.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Semina di cellule peritoneali in vetrini canale

1. Dopo aver pipettato la sospensione peritoneale delle cellule macrofagiche di topo su e giù per ridurre l'aggregazione, pipettare 100 μL di sospensione nel canale preriempito (volume, 100 μL) di un vetrino per canali rivestito di fibronectina (un canale da 100 μL ha le dimensioni (lunghezza x larghezza x altezza): 50 mm x 5 mm 0,4 mm).
   1. Preriempire la camera aggiungendo 1 mL di terreno RPMI 1640 (Hepes) integrato con siero a uno dei due serbatoi del vetrino del canale, inclinando il vetrino e quindi aspirando il terreno dal serbatoio a valle (Figura 1).
      1. Rimuovere le bolle d'aria indesiderate, o lunghe strisce d'aria, nel canale aggiungendo 1-2 ml di terreno a uno dei due serbatoi, applicando saldamente un tappo del serbatoio e quindi pompando l'aria attraverso la pressione ritmica del pollice sul tappo e, se necessario, inclinando il vetrino. Dopo aver espulso l'aria, inclinare il carrello con il serbatoio non tappato (e contenente il fluido) verso il basso prima di rimuovere il tappo per evitare che l'aria venga risucchiata nel canale.
2. Incubare il vetrino canale, seminato con le cellule, in una camera umida per 2 ore a 37 °C in assenza di CO₂ (CO₂ non è richiesto poiché il sistema tampone HCO₃-/CO₂ è sostituito da Hepes). Le guide del canale possono essere comodamente posizionate su un rack, che contiene otto vetrini. In genere, vengono preparati 6-8 vetrini da un mouse, anche se sono possibili fino a 10 o più.
3. Rimuovere il rack e sostituire il terreno RPMI 1640 (Hepes) in ciascun vetrino con il terreno RPMI 1640 contenente bicarbonato, integrato con il 10% di siero fetale bovino e penicillina/streptomicina.
   1. Inclinare la slitta e aspirare il fluido prima dal serbatoio inferiore e poi dal serbatoio superiore. Quindi, aggiungere 1 mL del nuovo terreno a uno dei serbatoi, inclinare il vetrino e aspirare il terreno dal serbatoio a valle, dopo che è fluito attraverso il canale.
   2. Dopo questa fase di lavaggio (scambio di fluido), riempire il vetrino del canale aggiungendo 1 mL di terreno a uno dei serbatoi.
      nota: Le fasi di lavaggio con vetrini a canale sono molto semplici ed efficaci in termini di scambio di soluzione e rimozione delle cellule non aderenti. Si noti che il terreno RPMI 1640 (bicarbonato) viene normalmente pre-incubato con il 5% di CO₂ durante la notte per garantire l'equilibrio termico e del pH.
4. Incubare le cellule per una notte a 37 °C in un incubatore umidificato con il 5% di CO₂. Esegui esperimenti il giorno successivo.

2. Isolamento dei globuli rossi umani

1. Il giorno 2 (il secondo giorno di esperimenti; dopo l'incubazione notturna dei macrofagi peritoneali isolati), raccogliere 1-2 ml di sangue venoso periferico da un donatore sano, in una provetta eparinizzato. Trasferire 1 mL in una provetta da microcentrifuga da 2,0 mL (polipropilene) a fondo tondo, centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 18 °C (impostazione empirica) e rimuovere il surnatante (plasma e buffy coat).
2. Aspirare delicatamente 100 μL di globuli rossi sedimentati e miscelare questo volume 1:1 con il terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato (descritto di seguito) in una provetta da microcentrifuga da 2,0 mL a fondo tondo. Etichettare il tubo "1:1".
   nota: Il terreno RPMI 1640 (Hepes) utilizzato il giorno 2 (per i saggi) dopo l'isolamento delle cellule contiene, oltre al 10% di siero fetale bovino inattivato termicamente, penicillina (100 unità/mL), streptomicina (100 μg/mL) e 1 mM di N-(2-mercaptopropionil)glicina (per ridurre la fototossicità). Di seguito, questo supporto è indicato come supporto RPMI 1640 (Hepes) "modificato".
3. Pipettare 4 μl della sospensione di globuli rossi diluita 1:1 in 2 mL di terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato, pre-pipettato in una provetta per microcentrifuga da 2,0 mL (ripetere questo passaggio, cioè preparare 2 provette). Etichettare ogni tubo "4:2000". Posizionare le provette "1:1" e "4:2000" sul ghiaccio.

3. Marcatura della membrana plasmatica dei macrofagi

1. Rimuovere i vetrini del canale seminato dall'incubatore di CO₂ e sostituire il terreno RPMI 1640 (bicarbonato) in ciascun vetrino con un terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato. Successivamente, porre le cellule in una camera umida a 37 °C in assenza di CO₂.
   nota: Dopo l'incubazione e il lavaggio notturni, la maggior parte dei linfociti viene rimossa dal canale. La maggior parte delle cellule aderenti rimanenti sono macrofagi, che possono essere identificati morfologicamente o mediante colorazione in immunofluorescenza utilizzando anticorpi anti-F4/80. Circa il 95% dei macrofagi peritoneali residenti nel topo sono F4/80 positivi.
2. Diluire l'anticorpo F4/80 anti-topo marcato con fluorescenza verde (conservato a 4 °C) 1:40 in terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato. Prendere un vetrino, inclinarlo e pipettare (goccia a goccia) 100 μl della miscela di anticorpi nell'apertura del canale da 100 μl del vetrino (vedere la Figura 1). Aspirare il mezzo che scorre nel serbatoio a valle. Incubare le cellule per 20 minuti a 37 °C (ambiente umidificato, senza CO₂). Durante il periodo di incubazione, marcare i globuli rossi umani (vedere paragrafo 5).
   nota: Come accennato in precedenza, la CO₂ non è necessaria poiché il sistema tampone HCO₃-/CO₂ è sostituito da Hepes.
3. Dopo 20 minuti di incubazione (durante i quali i globuli rossi umani vengono colorati e opsonizzati), lavare il vetrino aggiungendo 1 mL di terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato a uno dei serbatoi e aspirando il terreno dopo che è fluito attraverso il canale, facilitato dall'inclinazione del vetrino. Aggiungere 1 mL di terreno per la conservazione a breve termine o procedere a un esperimento (ad esempio, pipettaggio di particelle (globuli rossi opsonizzati) e imaging della fagocitosi mediante microscopia confocale a disco rotante time-lapse).

4. Etichettatura della membrana plasmatica dei globuli rossi umani

1. Iniziare la marcatura dei globuli rossi umani immediatamente dopo l'incubazione di un vetrino di macrofagi con anticorpo anti-F4/80 marcato in fluorescenza verde (dopo la Sezione 3.2). Dopo una delicata miscelazione, prelevare 400 μl da una delle provette "4:2000" (vedere la sezione 2.3) e dispensarlo in una provetta per microcentrifuga da 2,0 mL (fondo rotondo). Attendere che la sospensione si riscaldi a circa 37 °C (vedere paragrafo seguente). Aggiungere 0,4 μL di colorante per membrana plasmatica fluorescente arancione/rossa (aliquote conservate a -20 °C), mescolare e incubare a 37 °C per 5 min.
   nota: Un blocco di alluminio riscaldato, posto all'interno della cappa a flusso laminare, è utile per ridurre al minimo la dispersione di calore durante la preparazione dei vetrini. I tubi possono essere inseriti nei pozzetti del blocco riscaldante e una piastra di alluminio riscaldata separata o integrata può fungere da spazio di lavoro.
2. Dopo il periodo di incubazione di 5 minuti, preparare la prima fase di lavaggio aggiungendo 1600 μl di terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato (per riempire la provetta da microcentrifuga da 2,0 mL).
3. Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 minuti a 18 °C (impostazione empirica). Un pellet rosso compatto dovrebbe essere visibile sulla parete (cioè decentrato) nella parte inferiore del tubo. Ruotare la provetta in modo che il pellet sia rivolto verso l'alto e rimuovere con cautela tutto il surnatante in successione (in due fasi) utilizzando un puntale per pipetta da 1-1,5 mL.
4. Dopo aver aspirato il surnatante, aggiungere 2.000 μl di terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato, mescolare (per risospendere le cellule) e ripetere le fasi di centrifugazione e aspirazione del surnatante di cui sopra.
5. Risospendere il pellet (di globuli rossi colorati con membrana plasmatica e 2 globuli rossi lavati) con 400 μL di terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato. Etichettare il tubo PMS (abbreviazione di colorazione della membrana plasmatica).
   nota: In alternativa, l'estere succinimidil di un derivato della rodamina sensibile al pH, che diventa più fortemente fluorescente a pH acido, potrebbe essere utilizzato per marcare i globuli rossi umani. In questo caso, l'intensità della fluorescenza serve anche come misura della maturazione del fagosoma dopo che le particelle sono state internalizzate.

5. Opsonizzazione (marcatura) di globuli rossi umani con immunoglobuline G (IgG) di topo

1. Aggiungere 1 μL di anticorpo monoclonale di topo (IgG2b) (clone HIR2) anti-umano CD235a (1 mg/mL) (conservato a -20 °C) alla provetta marcata PMS (vedere Paragrafi 4.2-4.5), contenente globuli rossi umani colorati con membrana plasmatica sospesi in 400 μL di terreno. CD235a (nota anche come glicoforina A) è una sialoglicoproteina di membrana specifica per la linea eritroide.
2. Incubare a 37 °C per 8 minuti. Si noti che l'opsonizzazione dei globuli rossi umani con IgG provoca agglutinazione (aggregazione cellulare). Sebbene l'agglutinazione possa fungere da indicatore visivo di opsonizzazione, non è desiderabile per l'imaging di singoli effetti fagocitici. Per evitare l'agglutinazione, mescolare ripetutamente la sospensione cellulare (ogni 1 minuto) utilizzando, ad esempio, una pipetta con volume variabile di 20-200 μl impostata su 200 μl.
   1. Verso la fine del periodo di incubazione di 8 minuti, se lo si desidera, lavare il vetrino dei macrofagi, incubato con anticorpo anti-F4/80 marcato in fluorescenza verde, con 1 mL di terreno RPMI 1640 (Hepes) modificato. Assicurarsi che entrambi i serbatoi della guida del canale siano privi di fluido dopo le fasi di lavaggio.

6. Imaging della fagocitosi di globuli rossi umani colorati con membrana plasmatica e rivestiti di IgG

1. Dopo l'incubazione di 8 minuti con l'anticorpo anti-CD235a (Sezione 5.2), pipettare una sospensione da 100 μL contenente globuli rossi umani colorati con membrana plasmatica e opsonizzati con IgG nel canale di un vetrino contenente macrofagi marcati con anticorpo fluorescente verde anti-F4/80 (Fase 3). Pertanto, i globuli rossi rossi fluorescenti e opsonizzati con IgG vengono aggiunti ai fagociti fluorescenti verdi (macrofagi).
2. Non appena sono stati aggiunti i globuli rossi umani, montare il vetrino su un microscopio confocale a disco rotante (con l'incubatore del tavolino impostato a 37 °C) per l'imaging, ad esempio, tramite una lente dell'obiettivo a immersione in olio 60X/1,49. Iniziare l'imaging il prima possibile, poiché le particelle iniziano a depositarsi entro 1 min.
   nota: Utilizzando perline fluorescenti con un diametro di 100 nm, abbiamo misurato, mediante analisi delle funzioni di diffusione dei punti, risoluzioni XY di x = 0,22 μm, y = 0,23 μm (laser a 488 nm) e x = 0,27 μm, y = 0,27 μm (laser a 561 nm). Tuttavia, per ridurre il fotobleaching e la fototossicità durante l'imaging 3D time-lapse di cellule viventi, compromettiamo la risoluzione spaziale utilizzando il binning 2 x 2. Il binning aumenta la sensibilità (migliora il rapporto segnale/rumore) e la frequenza dei fotogrammi consentita, ma a scapito della risoluzione spaziale.
3. Utilizzare un sistema di messa a fuoco perfetta (o simile) per evitare la deriva della messa a fuoco durante le registrazioni. Dopo aver attivato il sistema di messa a fuoco perfetta, utilizzare il controllo dell'offset per mettere a fuoco le sporgenze lamellipodiali dei macrofagi immediatamente sopra il vetrino coprioggetti (vedi nota sotto) del vetrino del canale. Questo livello di messa a fuoco corrisponde a Z = 0 μm. Ottenere Z-stack da -1 μm a +16 μm con incrementi di 0,8 μm, che equivale a 22 Z-slice. Gli Z-stack possono, ad esempio, essere ottenuti ad una velocità di 1 stack (per ogni canale) ogni 15 s per un totale di 16 min.
   nota: I periodi di registrazione più lunghi soffrono di perdite di qualità dell'immagine, principalmente a causa del fotosbiancamento. Gli Z-stack vengono acquisiti per ciascuno dei due canali: i macrofagi vengono visualizzati utilizzando un laser a 488 nm (canale verde) e i globuli rossi umani vengono acquisiti utilizzando un laser a 561 nm (canale rosso). Utilizzando questo approccio, è possibile ottenere varie visualizzazioni dei macrofagi che ingeriscono globuli rossi umani opsonizzati con IgG in diversi punti temporali (ad esempio, vedi Figura 2><). nota: Le impostazioni tipiche del sistema (con binning 2 x 2) sono: canale verde (20,5% di potenza laser (50 mW; 488 nm), sensibilità 101 (intervallo, 0-255) e tempo di esposizione 200 ms); canale rosso (10,5% di potenza laser (50 mW; 561 nm), sensibilità 101 (intervallo, 0-255) e tempo di esposizione di 98 ms).
   nota: Il fondo del carrello è un polimero con lo stesso spessore di un vetrino coprioggetti #1.5 e le stesse proprietà ottiche del vetro, ma, in particolare, il materiale ha il vantaggio della permeabilità ai gas.

Risultati

Figura 1: Manipolazione di vetrini a canale rivestiti di fibronectina. (A) Uno scivolo a canale è costituito da due serbatoi collegati da un canale con dimensioni 50 mm x 5 mm 0,4 mm. I vetrini a canale vengono inizialmente preriempiti applicando 1-2 mL di terreno a uno dei due serbatoi e inclinando il vetrino. (B) I tappi possono essere posizionati sui serbatoi prima dell'incubazione. I tappi posson...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Catetere in plastica da 24 g	B Braun Mesungen AG, Germania	Numero 4254503-01	Utilizzato per il lavaggio peritoneale
Soluzione salina tamponata di Hank senza Ca2+ e Mg2+	Thermo Fisher Scientifico	14170120	Utilizzato per il lavaggio peritoneale
Provette a fondo tondo in polipropilene da 14 mL	Falco BD	352059	Utilizzato per raccogliere le cellule peritoneali
Terreno RPMI 1640 contenente 20 mM Hepes	Sigma-Aldrich	Visualizzazione R7388	Terreno di base per saggi
Siero fetale bovino inattivato a caldo	Thermo Fisher Scientifico	10082139	Utilizzato come supplemento per i supporti RPMI 1640
100x penicillina/streptomicina	Thermo Fisher Scientifico	15140122	Utilizzato come supplemento per i supporti RPMI 1640
Camere μ-Slide I rivestite di fibronectina	Ibidi, Martinsried, Germania	Codice 80102	Vetrini a canale utilizzati per i saggi
Cremagliera a μ guide (alluminio anodizzato)	Ibidi, Martinsried, Germania	80003	Rack impilabile autoclavabile per guide a canale
RPMI 1640 medium contenente bicarbonato	Sigma-Aldrich	Codice: R8758	Terreno per la coltura notturna
N-(2-mercaptopropionil)glicina	Sigma-Aldrich	Codice: M6635	Spazzino di specie reattive dell'ossigeno
Alexa Fluor 488-conjugated ratto (IgG2a) monoclonale (clone BM8) anticorpo F4/80 anticorpo	Thermo Fisher Scientifico	MF48020	Marcatore di macrofagi di topo ed etichetta della membrana plasmatica
CellMask Arancione	Thermo Fisher Scientifico	Visualizzazione del materiale C10045	Colorazione fluorescente rossa della membrana plasmatica
Estere succinimidilico di pHrodo	Thermo Fisher Scientifico	P36600	Estere succinimidilico reattivo all'ammina di pHrodo
Virus monoclonale di topo (IgG2b) (clone HIR2) anti-umano CD235a	Thermo Fisher Scientifico	MA1-20893	Usato per opsonizzare i globuli rossi umani con IgG
Alexa Fluor 594-coniugato capra anti-topo (secondario) anticorpo IgG	Abcam	Ab150116	Utilizzato per confermare l'opsonizzazione dei globuli rossi umani con IgG di topo
Anticorpo C3b/iC3b/C3c anti-topo di ratto	Hycult Biotech	HM1065	Utilizzato per confermare l'opsonizzazione C3b/iC3b dei globuli rossi umani
Alexa Fluor 488-coniugato capra anti-ratto anticorpo IgG	Thermo Fisher Scientifico	A-11006	Utilizzato come anticorpo secondario per confermare l'opsonizzazione C3b/iC3b
UltraVIEW Vox Sistema di imaging 3D su cellule vive	Perkin Elmer, Rodgau, Germania		Sistema di microscopio confocale a disco rotante
Microscopio inverso Nikon Eclipse Ti	Nikon, Giappone		Microscopio invertito
Scanner a disco rotante CSU-X1	Yokogawa Electric Corporation, Giappone		Unità disco rotante Nipkow
Telecamera Hamamatsu C9100-50 a 14 bit con dispositivo di coppia caricata a moltiplicazione di elettroni (EM-CCD) raffreddata a Peltier	Hamamatsu Photonics Inc., Giappone		Telecamera EM-CCD del sistema di microscopio confocale a disco rotante
Laser a stato solido da 488 nm, 50 mW	Perkin Elmer, Rodgau, Germania		Sorgente laser (488 nm) del sistema di microscopio confocale a disco rotante
Laser a stato solido da 561 nm, 50 mW	Perkin Elmer, Rodgau, Germania		Sorgente laser (561 nm) del sistema di microscopio confocale a disco rotante