Colorazione con calceina acetossimetile per valutare la citotossicità cellulo-mediata natural killer nei confronti delle cellule tumorali

Abstract

Fonte: Chava, S. et al., Misurazione della citotossicità e della migrazione mediata da cellule natural killer nel contesto delle cellule tumorali epatiche. (2020)

Questo video mostra un test per misurare la citotossicità delle cellule natural killer contro le cellule tumorali utilizzando la colorazione Calcein AM. Il numero ridotto di cellule tumorali fluorescenti a seguito di co-coltura con cellule natural killer indica la citotossicità mediata da cellule natural killer nei confronti delle cellule tumorali.

Protocollo

1. Metodo microscopico basato sulla colorazione Calcein AM per misurare la citotossicità cellulo-mediata NK

1. Coltura di cellule SK-HEP-1 con confluenza del 70-80%. Generare una sospensione a singola cellula lavando prima le cellule con 5 mL di 1x PBS seguite dall'incubazione con 1 mL di tripsina-EDTA allo 0,25%.
2. Centrifugare le cellule SK-HEP-1 in una provetta da centrifuga sterile da 1 mL a 160 x g per 3 min. Risospendere il pellet in 3 mL di DMEM privo di siero.
3. Aggiungere 1,5 μL di soluzione AM di calceina (10 mM) alle cellule SK-HEP-1 e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare le cellule SK-HEP-1 marcate con AM calcein a 160 x g per 3 minuti in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL.
4. Lavare le celle due volte con 5 mL di 1x PBS per rimuovere l'eccesso di colorante AM calcicina.
5. In parallelo, centrifugare le cellule NK92MI a 160 x g per 3 minuti in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Lavare una volta il pellet cellulare con 5 mL di 1x PBS e risospendere in 5 mL di terreno cellulare NK92MI.
6. Contare le cellule SK-HEP-1 marcate con calceina AM e le cellule NK92MI utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
7. Risospendere le cellule SK-HEP-1 nel terreno di coltura a 1 x 10⁵ cellule/mL e le cellule NK92MI a 1 x 10⁶ cellule/mL nel terreno di coltura NK.
8. Piastre di calceina AM marcate con cellule SK-HEP-1 (cellule bersaglio) (1 x 10⁴/100 μL/pozzetto) con cellule NK92MI (cellule effettrici) (1 x 10⁵/100 μL/pozzetto) (1:10 target: rapporto effettore) per pozzetto in pozzetti triplicati in una piastra da 96 pozzetti.
9. Incubare le piastre a 96 pozzetti a 37 °C in un'atmosfera di 95% aria e 5% CO₂ per 4 ore. Dopo l'incubazione, acquisire immagini a fluorescenza delle cellule marcate con calceina AM utilizzando un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 10x. Cattura almeno 10 campi diversi di ogni replica per ogni condizione di trattamento.
10. Selezionare casualmente 10 immagini per ogni replica e contare le cellule bersaglio marcate con calceina AM-positive incubate con o senza cellule NK92MI. Calcolare la % di citotossicità utilizzando la formula seguente.
    
    nota: Come controlli, utilizzare cellule target senza cellule NK92MI e cellule target completamente lisate come controllo completo della lisi. Per una lisi completa, incubare le cellule in Triton X-100 allo 0,5% per 1 ora (20 μL di Triton X-100 al 5% in 200 μL di terreno di coltura).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Colorante Calceina AM	Sigma-Aldrich	Anno 17783
DMEM	Gibco	Codice 11965-092
Siero fetale bovino	Gibco	26140079
Siero di cavallo	Gibco	16050114
Celle NK92MI	ATCC	Codice CRL-2408
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Celle SKHEP-1	ATCC	HTB-52
Soluzione di tripsina EDTA	Gibco	25200056