Misurazione della migrazione delle cellule natural killer in risposta a stimoli chemiotattici

Abstract

Fonte: Chava, S., et al. Misurazione della citotossicità e della migrazione mediata da cellule natural killer nel contesto delle cellule tumorali epatiche. (2020).

Questo video dimostra un metodo per studiare la migrazione delle cellule natural killer (NK) attraverso un sistema di inserti a membrana porosa in risposta ai chemioattrattivi. Questo metodo consente l'analisi quantitativa della migrazione delle cellule NK mediante citometria a flusso.

Protocollo

1. Saggio di migrazione cellulare NK

1. Coltivare le cellule NK92MI e centrifugare le cellule a 160 x g per 3 minuti in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL.
2. Lavare due volte il pellet cellulare con 5 mL di 1x PBS e risospendere le cellule in 3 mL di terreno cellulare NK92MI privo di siero. Contare le cellule NK92MI utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato.
3. Piastra delle celle NK92MI (2,5 x 10,⁵ celle/100 μL/pozzetto) nel compartimento superiore della camera permeabile del pozzetto (inserto di 6,5 mm di diametro e dimensione dei pori di 5 μm).
4. Nella camera inferiore aggiungere 0,6 mL di terreno privo di siero contenente materiale da testare per le proprietà chemioattrattive delle cellule NK (ad esempio, terreno condizionato, chemochine, citochine).
   nota: Quando si prepara il terreno condizionato, utilizzare un terreno sierologico ridotto senza siero aggiunto per eliminare l'interferenza delle proteine sieriche nel saggio di migrazione.
5. Incubare le 24 camere permeabili a 37°C per 4 ore. Dopo 4 ore, raccogliere le cellule NK92MI non aderenti e migrate dalla camera inferiore e trasferirle in provette di smistamento cellulare attivate da fluorescenza (FACS) per ulteriori analisi.
   nota: Il tempo di coltura può variare a seconda del tipo di cellule bersaglio, nonché della quantità e della cinetica delle chemochine prodotte dalle cellule bersaglio. Pertanto, questo tempo dovrebbe essere determinato empiricamente per ogni tipo di cellula, chemochina ed esperimento.
6. Aggiungere un numero predeterminato di microsfere di conteggio per citometria a flusso in un volume di 50 μl a ciascuna provetta contenente le cellule NK migrate. Valutare il volume di 300 μL/pozzetto di sospensione cellulare utilizzando qualsiasi citometro a flusso in grado di contare le cellule automatizzate basate su FACS.
   nota: Mescolare accuratamente le microsfere di conteggio per la citometria a flusso ogni volta prima dell'uso per garantire che venga utilizzato un numero costante di perle per ridurre al minimo la variabilità sperimentale. Si consiglia il pipettaggio inverso con microsfere di conteggio per mantenere l'accuratezza. Utilizzare solo cellule NK e microsfere di conteggio per la citometria a flusso come controlli dell'analisi FACS. Gli autori raccomandano di leggere almeno 10.000 perline + cellule NK combinate, una quantità che ha funzionato bene. Tuttavia, questo numero può variare a seconda delle condizioni sperimentali. Pertanto, il numero combinato di perle + cellule NK dovrebbe essere determinato empiricamente per ogni tipo di esperimento. Inoltre, è importante eseguire esperimenti utilizzando triplicati biologici per ottenere risultati statisticamente significativi e per tenere conto della variabilità tra le diverse conta cellulare.
7. Calcola il numero assoluto di cellule NK92MI migrate utilizzando questa formula:
   
   dove A = numero di cellule, B = numero di perle, C = conteggio delle microsfere assegnato del lotto (numero di perle di conteggio per citometria a flusso/50 μL; in questo esempio 49.500) e D = volume del campione (μL).
   nota: Se si utilizzano 300 μL di volume di campione (cellule migrate) per l'analisi FACS con 50 μL di microsfere di conteggio per citometria a flusso, il numero assoluto di cellule migrate = 1.700 cellule/3.300 eventi di microsfere x 49.500 microsfere/300 μL = 84,975 cellule/μL. Il calcolo deve essere corretto se il campione viene diluito o se viene utilizzato un volume diverso di microsfere di conteggio FACS.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Perline di conteggio assoluto	Thermo Fisher Scientifico	Codice: C36950
Celle NK92MI	ATCC	Codice CRL-2408
Celle SKHEP-1	ATCC	HTB-52
Camere permeabili al pozzetto	Costar	Codice: 3241
Opti-MEM	Gibco	31985070
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Alfa-MEM	Sigma-Aldrich	Codice: M4256