$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Prepara il Complemento e i Batteri Bersaglio
- Preparare il complemento per coniglietti (BRC)
NOTA: I criteri dettagliati per la selezione del lotto di complemento sono disponibili qui: https://www.vaccine.uab.edu/uploads/mdocs/UAB-MOPA.pdf
- Ottenere il BRC congelato e scongelarlo con acqua fredda corrente. Mescolare fisicamente il BRC ogni ~10-20 minuti fino a completo scongelamento. Non sottoporre BRC a ripetuti cicli di gelo-disgelo.
- Durante lo scongelamento del BRC, etichettare le provette da centrifuga da 1,5 mL, 5 mL o 15 mL. Posizionare i tubi etichettati sul ghiaccio per pre-raffreddarli. Aliquotare il volume corretto di BRC nelle provette da centrifuga pre-raffreddate (dopo il riempimento, rimettere immediatamente ciascuna provetta nel ghiaccio). Conservare le aliquote a ≤ -70 °C in congelatore.
nota: Per ogni piastra di saggio è necessario circa 1 mL di complemento. Le aliquote del complemento sono monouso e devono essere aliquotate in volumi appropriati ai layout dei saggi.
- Per preparare il BRC inattivato a caldo, scongelare un'aliquota di BRC attivo. Preparare un bagnomaria a 56 °C. Dopo che il BRC è completamente scongelato, trasferirlo a bagnomaria e incubare per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione, rimuovere il BRC inattivato termicamente dal bagnomaria e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente (RT) per 10-15 minuti. Mescolare energicamente e aliquotare provette per microcentrifuga da ~150 μl in 1,5 mL. Conservare le aliquote a ≤ -10 °C.
- Preparare il brodo batterico target
NOTA: La procedura seguente viene utilizzata per preparare 48 aliquote di stock di batteri bersaglio; Se sono necessarie più aliquote, il protocollo può essere scalato.
- Rimuovere la fiala di brodo per i batteri dal congelatore e raschiare la superficie batterica congelata per rimuovere una piccola quantità di ghiaccio dalla fiala su una piastra di agar sanguigno. Rimettere immediatamente la fiala di scorta principale nel congelatore.
- Strisciare questa piccola aliquota di brodo batterico sulla piastra di agar sanguigno e coprirla con il coperchio della piastra. Incubare la piastra capovolta per una notte in un incubatore a 37 °C/5% CO2
.
- Trasferire ~10 colonie lisce isolate in una provetta da 50 mL contenente 30 mL di brodo LB. Incubare per 3-5 ore a 37 °C agitando delicatamente fino a quando il brodo di coltura non ha un OD600 di ~0,6-0,7.
- Raccogliere i 12,5 mL superiori della coltura e trasferirli in una provetta fresca da 50 mL. Centrifugare la coltura a 15.000 x g per 2 minuti utilizzando una microcentrifuga da tavolo. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 25 mL di glicerolo-LB sterile al 15%.
- Mescolare bene ed erogare aliquote da 0,5 mL in provette sterili da microcentrifuga da 1,5 mL (~48 provette). Conservare le aliquote a ≤ -70 °C in congelatore.
- Confermare l'identità batterica utilizzando il test di agglutinazione prima dell'uso.
- Determinazione del fattore di diluizione ottimale per i batteri bersaglio stock
NOTA: Ogni lotto di batteri bersaglio deve essere titolato in condizioni di saggio per determinare la diluizione necessaria per produrre ~120 CFU/spot su piastre LB.
- Procuratevi una piastra per microtitolazione (piastra di diluizione) e aggiungete 135 μl di tampone per il saggio al pozzetto 1A. Aggiungete 120 μl di burro per il saggio ai pozzetti 1B-1H.
- Estrarre una fiala di batteri bersaglio congelati dal congelatore e scongelare a temperatura ambiente. Aggiungere 15 ul di brodo batterico scongelato al pozzetto 1A per ottenere una diluizione di 10 volte del brodo batterico.
- Trasferire 30 μL di soluzione batterica dal pozzetto 1A al pozzetto 1B per eseguire una diluizione seriale di 5 volte. Continuare le diluizioni seriali di 5 volte fino a pozzetto 1H per un totale di 8 diluizioni (1:10; 1:50; 1:250; 1:1 250; 1:6 250; 1:31 250; 1:156 250; 1:781 250).
- Procuratevi un'altra piastra per microtitolazione (piastra di saggio) e aggiungete 20 μl di tampone di saggio a tutti i pozzetti nelle colonne 1 e 2 della piastra di saggio.
- Trasferire 10 μl di batteri diluiti da ciascun pozzetto nella colonna 1 della piastra di diluizione nei pozzetti corrispondenti nelle colonne 1 e 2 della piastra di saggio. 10 μl di batteri vengono trasferiti dal pozzetto 1A della piastra di diluizione nei pozzetti 1A e 2A della piastra di saggio, ecc.
- Continuare con il test come descritto nel test battericida sierico (SBA) di seguito per il controllo A e il controllo B, passaggi 3.6-3.12.
- Dopo che le piastre sono state incubate su ghiaccio, utilizzare una pipetta multicanale con 8 puntali per individuare 10 μl dai pozzetti della colonna 1 su una piastra LBA. Inoltre, individua i pozzetti dalla colonna 2 sulla piastra LBA.
- Continuare con il test come descritto di seguito nei passaggi 3.14-4.6.
- Determinare la diluizione batterica che produce ~120 CFU/spot nel controllo B, questa diluizione verrà utilizzata nel saggio.
2. Dosaggio battericida del siero (SBA)
NOTA: La procedura descritta di seguito è per una piastra di analisi, ma il numero di piastre di analisi può essere aumentato.
- Inattivare termicamente i campioni di prova incubandoli in un bagno d'acqua a 56 °C per 30 min.
nota: I campioni di prova devono essere inattivati a caldo prima del test per abrogare qualsiasi attività endogena del complemento. Questo può essere fatto prima del test e i campioni inattivati possono essere ricongelati o conservati a 4 °C fino al test.
- Procuratevi una piastra di analisi e aggiungete 20 μl di tampone di analisi alle colonne da 1 a 12 delle righe da A a G. Aggiungete 20 μl di tampone di analisi alle colonne 1 e 2 della riga H, vedere la Tabella 1.
- Caricare 30 μl di ciascun campione di prova, in duplicato, nella riga H della piastra di saggio. Ad esempio, erogare 30 μL di campione 1 nei pozzetti 3H e 4H e 30 μL di campione 2 nei pozzetti 5H e 6H, ecc.
- Eseguire diluizioni seriali di 3 volte dei campioni di prova utilizzando una pipetta multicanale.
- Rimuovere 10 μ del campione dai pozzetti 3H-12H e trasferirlo nei pozzetti corrispondenti nella fila G e mescolare il pozzetto del campione pipettando su e giù 8-10 volte.
- Quindi rimuovere 10 μ dai pozzetti 3G-12G e trasferirli nei pozzetti corrispondenti nella fila F e mescolare bene.
- Continuare queste diluizioni seriali fino alla riga A. Dopo aver mescolato i pozzetti della fila A, rimuovere ed eliminare 10 μl dai pozzetti 3A-12A in modo che tutti i pozzetti contengano 20 μl.
nota: Poiché vengono utilizzati 20 μl di siero in un volume totale del saggio di 80 μl, il test offre una diluizione aggiuntiva di 4 volte. Questa diluizione deve essere presa in considerazione durante il calcolo di un titolo SBA moltiplicando la diluizione del siero per 4. Ad esempio, se si utilizza una diluizione iniziale di 1:2, la diluizione effettiva da testare è 1:8.
- Rimuovere una fiala di brodo di batteri bersaglio congelato e scongelare a temperatura ambiente. Diluire i batteri in 20 mL di Assay Buffer secondo il fattore di diluizione ottimale predeterminato (questo fattore di diluizione è stato determinato nella sezione 1.3). Aggiungere 10 μl di batteri diluiti a ciascun pozzetto della piastra di analisi utilizzando una pipetta multicanale.
- Rimuovere una fiala di BRC congelato e una fiala di BRC congelato inattivato dal calore, scongelare a temperatura ambiente con acqua fredda corrente o posizionare sulla griglia di una cabina di sicurezza biologica con aria soffiata per scongelare rapidamente.
- Preparare una soluzione al 20% di BRC inattivato termicamente. Miscelare 100 μl di BRC inattivato termicamente con 400 μl di tampone per saggi. Aggiungere 50 μl di questa soluzione BRC inattivata termicamente al 20% a tutti i pozzetti della colonna 1 (pozzetti di controllo A).
nota: Il BRC inattivato a caldo viene utilizzato come controllo per monitorare l'uccisione non specifica (NSK) nel saggio.
- Preparare una soluzione al 20% di BRC nativo. Miscelare 1 mL di BRC nativo con 4 mL di tampone per saggi. Aggiungere 50 μl di questa miscela a tutti i pozzetti nelle colonne da 2 a 12 (pozzetti di controllo B e campioni di prova).
nota: La concentrazione finale di BRC nella miscela di reazione è del 12,5%.
- Miscelare brevemente la piastra del saggio agitando delicatamente per 10-15 s su un agitatore per piastre o miscelare pipettando su e giù 8 volte utilizzando una pipetta multicanale.
- Mettere la piastra di analisi in un incubatore microbiologico a 37 °C per 2 ore (senza agitare).
- Asciugare 2 piastre LBA rimuovendo i coperchi e posizionando le piastre a faccia in su nella cabina di sicurezza biologica per 40-60 minuti.
- Al termine dell'incubazione di 2 ore, spostare la piastra del saggio sul ghiaccio umido e incubare per 10-20 minuti per arrestare la reazione.
- Utilizzando una pipetta a 12 canali, miscelare i pozzetti della fila H e posizionare 10 μl della miscela di reazione sul fondo di una piastra LBA. Inclinare immediatamente la piastra e lasciare che i punti scorrano per ~1,5-2 cm. Ripetere questa procedura per le righe G, F ed E, individuandole sopra la riga precedente sulla piastra LBA. Le righe E, F, G e H sono individuate su una piastra LBA e le righe A, B, C e D sono individuate su una seconda piastra LBA allo stesso modo, vedere la Figura 1.
- Incubare le piastre LBA a temperatura ambiente fino a quando la soluzione non viene adsorbita nelle piastre LBA (10-15 min). Mettere i coperchi sulle piastre LBA e posizionare le piastre LBA nell'incubatore microbiologico capovolte per incubare durante la notte (~16-18 h). Incubare Shigella flexneri 2a e 3a a 29 °C e incubare S. sonnei a 26 °C.
nota: Queste temperature producono "micro-colonie" più piccole con dimensioni adatte per un conteggio accurato da parte di un contatore di colonie9.
- Dopo l'incubazione notturna, aggiungere 25 mL di Overlay Agar (a ~55 °C) contenente 100 μg/mL di TTC e 0,1% di NaN3 a ciascuna piastra LBA.
- Incubare le piastre LBA a 37 °C per 2 ore per consentire ai batteri sopravvissuti di sviluppare un colore rosso, vedere la Figura 1 di seguito.
- Fotografare le lastre utilizzando una fotocamera digitale e trasferire le immagini su un computer in cui è stato installato il software integrato di enumerazione delle colonie (NICE) del NIST, vedere Figura 2.
nota: Il software per il conteggio delle colonie NICE è disponibile gratuitamente. Vedere l'elenco dei materiali per i dettagli e le istruzioni di installazione.
Tabella 1: Layout della piastra di analisi. Le colonne 1 e 2 contengono i pozzetti di controllo del complemento. Il controllo A si trova nella colonna 1 ed è il controllo del complemento inattivato dal calore, contenente tampone SBA, batteri e complemento inattivato dal calore. Il controllo B si trova nella colonna 2 ed è il controllo attivo del complemento, contenente tampone SBA, batteri e complemento. Le colonne 3-12 contengono campioni di siero. Ogni campione viene eseguito in duplicato e diluito in serie 3 volte dalla riga H alla riga A
| 1 | numero arabo | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| un | Controllo A | Controllo B | Diluizione 8 | Diluizione 8 | Diluizione 8 | Diluizione 8 | Diluizione 8 | Diluizione 8 | Diluizione 8 | Diluizione 8 | Diluizione 8 | Diluizione 8 |
| E | Controllo A | Controllo B | Diluizione 7 | Diluizione 7 | Diluizione 7 | Diluizione 7 | Diluizione 7 | Diluizione 7 | Diluizione 7 | Diluizione 7 | Diluizione 7 | Diluizione 7 |
| E | Controllo A | Controllo B | Diluizione 6 | Diluizione 6 | Diluizione 6 | Diluizione 6 | Diluizione 6 | Diluizione 6 | Diluizione 6 | Diluizione 6 | Diluizione 6 | Diluizione 6 |
| D | Controllo A | Controllo B | Diluizione 5 | Diluizione 5 | Diluizione 5 | Diluizione 5 | Diluizione 5 | Diluizione 5 | Diluizione 5 | Diluizione 5 | Diluizione 5 | Diluizione 5 |
| E | Controllo A | Controllo B | Diluizione 4 | Diluizione 4 | Diluizione 4 | Diluizione 4 | Diluizione 4 | Diluizione 4 | Diluizione 4 | Diluizione 4 | Diluizione 4 | Diluizione 4 |
| E | Controllo A | Controllo B | Diluizione 3 | Diluizione 3 | Diluizione 3 | Diluizione 3 | Diluizione 3 | Diluizione 3 | Diluizione 3 | Diluizione 3 | Diluizione 3 | Diluizione 3 |
| E | Controllo A | Controllo B | Diluizione 2 | Diluizione 2 | Diluizione 2 | Diluizione 2 | Diluizione 2 | Diluizione 2 | Diluizione 2 | Diluizione 2 | Diluizione 2 | Diluizione 2 |
| H | Controllo A | Controllo B | Diluizione 1 | Diluizione 1 | Diluizione 1 | Diluizione 1 | Diluizione 1 | Diluizione 1 | Diluizione 1 | Diluizione 1 | Diluizione 1 | Diluizione 1 |
| | | Campione 1 | Campione 2 | Campione 3 | Campione 4 | Campione 5 |
