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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Preparazione di timociti apoptotici marcati con CFSE
- Eutanasia di due topi C57/B6 naïve mediante inalazione di CO2 per 10 minuti e sezionare per aprire la cavità toracica, rimuovere (estrarre) il timo con una pinza a punta fine curva in una capsula di Petri per coltura tissutale contenente 10 ml di RPMI1640 terreno.
- Ottenere una sospensione unicellulare macinando l'intero timo contro due estremità smerigliate dei vetrini del microscopio e quindi filtrare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 100 μm.
- Raccogliere la sospensione di timo da 10 mL in una provetta da 50 mL e centrifugare a 300 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante, risospendere in 40 mL di 1x PBS e contare il numero di cellule con un emocitometro.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min e rimuovere il surnatante.
- Risospendere in 20 mL di 1x PBS in una provetta da 50 mL come sospensione a cellula singola con un massimo di 2 x 108 cellule (se più di 2 x 108 cellule, risospendere il resto delle cellule in altri 20 mL di 1 x PBS in una diversa provetta da 50 mL).
- Preparare 5 μM di CFSE in un volume uguale (20 mL) di 1x PBS in una provetta separata da 50 mL pipettando 40 μL di soluzione madre di CFSE (2,5 mM) in 20 mL di 1x PBS e mescolare bene capovolgendo la provetta 2 - 3 volte.
- Aggiungere i 20 mL di CFSE del passaggio 1.7 ai 20 mL di sospensione cellulare del passaggio 1.6 (la concentrazione finale di CFSE è ora di 2,5 μM).
nota: Per ogni sospensione cellulare da 20 mL, è necessaria una provetta CFSE da 20 mL.
- Capovolgere la cella e la provetta della miscela CFSE 2 - 3 volte e incubare la miscela al buio a temperatura ambiente per un massimo di 2 minuti, quindi interrompere la reazione aggiungendo 10 ml di siero di cavallo inattivato termicamente.
- Centrifugare la miscela di provette da 50 mL a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
nota: Se l'etichettatura CFSE ha esito positivo, il pellet della cella diventerà giallo chiaro.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 40 mL di 1x PBS e contare il numero di cellule con un emocitometro.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
- Lavare nuovamente il pellet della cella con 40 mL di RPMI1640 terreno.
- Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con RPMI1640 terreno di coltura tissutale (RPMI1640, 20 mM HEPES, 10% FBS (inattivato a caldo), 20 mM di glutammina e 1x Pen/Streptococco) a una concentrazione di 7 x 106 cellule/mL in una piastra di coltura tissutale da 100 mm.
nota: Se si ottengono più cellule, sarà necessaria una piastra di coltura tissutale separata da 100 mm.
- Aggiungere la staurosporina nella coltura in sospensione cellulare a una concentrazione finale di 1 μM e coltivare per 4 ore a 37 °C in un incubatore per colture tissutali fornito con CO2 al 5%.
2. Preparazione dei macrofagi peritoneali
- Iniettare due topi C57B6 (o qualsiasi topo manipolato geneticamente in laboratorio) per via intraperitoneale con 1 mL di tioglicolato invecchiato al 3% al giorno 0.
- Sopprimere i topi il giorno 5 come al punto 1.1, tagliare e sbucciare la pelle addominale ma lasciare intatto il peritoneo. Lavare la cavità peritoneale spingendo rapidamente 10 mL di tampone di lavaggio (RPMI1640, 2% FBS, 0,04% EDTA) nella cavità peritoneale utilizzando una siringa da 10 mL collegata a un ago da 18 G.
- Recuperare lentamente il tampone di lavaggio con lo stesso ago/siringa e raccoglierlo in una provetta da 50 ml.
- Lavare due volte la sonda peritoneale con 1x PBS, risospendere i macrofagi peritoneali in RPMI1640 terreno di coltura tissutale a una densità di 2 x 106 cellule/mL e aliquotare 500 μL in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Lasciare la piastra in un incubatore per colture tissutali per 2 ore.
- Rimuovere le cellule galleggianti aspirandole e sostituendole con 500 μL di terreno di coltura fresco, due volte.
- Facoltativamente, aggiungere l'inibitore della tirosina del recettore TAM, RXDX-106, alle concentrazioni indicate nelle legende delle figure in ciascun pozzetto della coltura di macrofagi e incubare per altre 2 ore.
3. Co-coltura di macrofagi peritoneali con timociti apoptotici
- Raccogliere i timociti apoptotici dal passaggio 1 e lavare tre volte con RPMI1640 terreno. L'efficienza dell'induzione apoptotica può essere misurata in questa fase con il kit Annexin V/7-AAD.
- Distribuire 0 - 12 x 106 cellule (in terreno da 500 μL) in ciascun pozzetto delle colture di macrofagi del protocollo #2, secondo la disposizione sperimentale (ad esempio, vedere la Figura 1). In questo modo l'intero volume di coltura è di 1 mL in ciascun pozzetto della piastra a 24 pozzetti. Aggiungere l'anticorpo bloccante nella coltura immediatamente prima dell'aggiunta di timociti apoptotici.
- Coltivare la miscela cellulare a 37 °C per 4 ore in un incubatore per colture tissutali con CO2 al 5%.
- Lavare due volte ogni pozzetto della coltura con 1x PBS (contenente 500 μM di EDTA) per rimuovere le cellule apoptotiche libere.
- Colorare i macrofagi legati alla placca con CD11b-PE in questa fase.
- Lavare una volta i macrofagi legati alla piastra con un tampone colorante (1x PBS, 1% BSA).
- Aggiungere 200 μL di tampone di colorazione contenente 2 μL di CD11b-PE in ciascun pozzetto.
- Incubare la piastra a 4 °C per 20 minuti.
- Lavare ogni pozzetto della piastra tre volte con il tampone colorante.
- Aggiungere 200 μl di tampone di colorazione e procedere con la piastra per l'analisi delle immagini al microscopio a fluorescenza.
