Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Raccolta del siero
- Raccogli campioni di siero dagli esseri umani nei punti di interesse. Per questo studio, abbiamo raccolto sieri ai giorni 0 (tempo della vaccinazione antinfluenzale), +7, +30, +60 e +180 dopo la vaccinazione.
- Per ottenere il siero, centrifugare le provette del campione a 1.200 x g per 10 minuti a temperatura ambiente (20 - 25 °C).
nota: I campioni di sangue non centrifugati devono essere conservati a 4 °C e per non più di 24 ore.
- Aliquotare il siero in diverse provette (criofiale) e congelare a -80 °C fino al momento dell'uso.
- Eseguire i saggi successivi per lotto, includendo tutti i punti temporali di una persona per ridurre la variabilità all'interno di un paziente.
2. Preparazione degli antigeni
ATTENZIONE: Vengono utilizzati cinque diversi antigeni (vedi Tabella dei Materiali). Preparare gli antigeni in un laboratorio di biosicurezza di livello 2 (BSL-2).
- Secondo le istruzioni del produttore, ricostituire il contenuto totale di una fiala liofilizzata dell'antigene influenzale con 1,0 ml di acqua distillata e lasciare riposare l'antigene disciolto per almeno 5 minuti a temperatura ambiente prima di procedere.
- Aliquotare la soluzione antigenica in provette da 1,5 mL e congelare a -80 °C fino a nuovo utilizzo.
3. Preparazione del filtrato di colera
NOTA: Il filtrato di colera è usato come enzima che distrugge i recettori (RDE) secondo il protocollo dell'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Questo rimuove gli inibitori innati dal siero che interferirebbero con il test.
- Ricostituire l'RDE liofilizzato secondo le istruzioni del produttore.
- Conservare la soluzione RDE in una provetta da 15 mL a 4 °C fino a nuovo utilizzo.
4. Saggio HA
NOTA: Per garantire che i saggi di inibizione dell'emoagglutinazione (HI) siano comparabili tra diverse piastre, è necessario utilizzare la stessa quantità di particelle virali per ciascuna piastra. Il test di emoagglutinazione (HA) (chiamato anche titolazione HA) viene eseguito per quantificare le particelle virali necessarie per l'emoagglutinazione e viene registrato in unità HA. Un'"unità" di emoagglutinazione è un'unità operativa dipendente dal metodo utilizzato per la titolazione dell'HA e non è una misura di una quantità assoluta di virus. Pertanto, un'unità HA è definita come la quantità di virus necessaria per agglutinare un volume uguale di una sospensione di globuli rossi standardizzata. Secondo l'OMS, la quantità standard utilizzata per il test HI è di 4 unità HA per 25 μL. Per un'illustrazione del principio del test HA, vedere la Figura 1.
NOTA: I globuli rossi (RBC) utilizzati dipendono dal tipo di virus influenzale nel test (Tabella 1). Inoltre, per vari tipi di piastre per microtitolazione a 96 pozzetti, il tempo di incubazione e l'aspetto delle cellule non agglutinate differiscono (Tabella 2).
- Preparazione della sospensione RBC
- Diluire la sospensione madre di globuli rossi (10%, v/v; eccetto il tipo O umano) (vedere la tabella dei materiali) con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per ottenere le concentrazioni corrette per i globuli rossi di uccelli e mammiferi rispettivamente dello 0,75% e dell'1%.
- Preparazione della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti
NOTA: Vedere la Figura 2 per una panoramica del design della targa.
- Aggiungere 25 μl di PBS ai pozzetti da 1 a 12 di ciascuna fila utilizzata di una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale (Figura 2). Utilizzare la piastra per microtitolazione a forma di V quando si lavora con globuli rossi aviari, come pollo e tacchino. Utilizzare la piastra per microtitolazione a forma di U quando si lavora con i globuli rossi dei mammiferi, come i porcellini d'India e il tipo umano O (Tabella 2).
- Aggiungere 25 μL di antigene dell'influenza al primo pozzetto delle file di antigeni, che sono disposte in duplicati. Nessun antigene viene aggiunto alle righe di controllo. Le righe di controllo non devono mostrare un effetto emoagglutinazione e fungere da controlli negativi (Figura 2).
- Eseguire una diluizione seriale di 2 volte trasferendo 25 μl dal primo pozzetto delle file di antigene ai pozzetti successivi utilizzando una pipetta multicanale. Miscelare ogni fase di diluizione pipettando delicatamente su e giù 10 volte.
- Scartare gli ultimi 25 μl degli ultimi pozzetti.
- Aggiungere 25 μl di PBS ai pozzetti da 1 a 12 di ciascuna fila utilizzata utilizzando una pipetta multicanale, per raggiungere un volume totale di 50 μl per pozzetto.
- Aggiungere 50 μl di sospensione di globuli rossi a ciascun pozzo utilizzato utilizzando una pipetta multicanale.
- Picchiettare con cura il piatto 10 volte su tutti e quattro i lati per mescolare.
- Coprire la piastra con un coperchio e incubare a temperatura ambiente per il periodo di tempo appropriato a seconda delle specie di globuli rossi utilizzate (vedere Tabella 2). Non spostare la piastra durante l'incubazione.
- Lettura della targa
NOTA: La lettura è leggermente diversa quando si utilizzano globuli rossi aviari rispetto ai globuli rossi dei mammiferi, a causa della diversa forma dei pozzetti per microtitolazione (Figura 3).
- Lettura dei globuli rossi aviari
- Inclinare la piastra di 90° per 25 s.
nota: Il punto finale della titolazione HA è l'ultimo pozzetto in cui si verifica l'emoagglutinazione completa. Questo pozzetto contiene 1 unità HA di virus. A causa delle diluizioni di 2 volte dell'antigene, due pozzetti prima dell'endpoint di titolazione dell'HA è il pozzetto che contiene 4 unità di HA di virus (Figura 4).
- Contrassegnare immediatamente i risultati, mentre la piastra è ancora in posizione inclinata, su uno schema stampato della piastra a 96 pozzetti. I modelli di agglutinazione dei globuli rossi aviari sono mostrati nella Figura 3.
- Lettura dei globuli rossi dei mammiferi
- Contrassegnare i risultati su uno schema stampato della piastra a 96 pozzetti, senza inclinare la piastra (posizione orizzontale sul banco).
nota: Quando si verifica l'emoagglutinazione, le cellule agglutinate non si depositano sul fondo, mentre le cellule non agglutinate appaiono come un alone sul fondo del pozzetto. L'alone delle cellule parzialmente agglutinate è meno intenso e ha un diametro maggiore (Figura 3).
- Determinazione di 4 unità HA.
nota: L'inclinazione della piastra è fondamentale per la differenziazione dei modelli aviari perché tutti e tre i diversi tipi di modelli di agglutinazione (completamente agglutinato, parzialmente agglutinato e non agglutinato) appaiono come un pulsante quando non inclinati.
5. Saggio HI
NOTA: Il flusso di lavoro del protocollo è stato ottimizzato per consentire una gestione più efficiente di più campioni contemporaneamente, utilizzando strisce di provette con reazione a catena della polimerasi (PCR) e un termociclatore (vedi sotto).
- Preparazione dei campioni di siero
nota: Preparare campioni di siero in un laboratorio di livello di biosicurezza 2 (BSL-2).
- Scongelare i campioni di siero congelati di ogni punto temporale di ogni persona (vedere il passaggio 1.2) a temperatura ambiente.
- Aggiungere un'aliquota di 10 μl di ciascun campione di siero scongelato a una provetta di striscia di provette PCR (10 provette in una striscia).
nota: Il grande vantaggio dell'utilizzo di strisce di provette per PCR è che una pipetta multicanale può essere utilizzata per le fasi successive del test HI; Ciò consente di risparmiare molto tempo quando si analizza un gran numero di campioni di siero e quando si eseguono misure ripetute degli stessi campioni per i titoli anticorpali contro diversi ceppi virali.
- Conservare i campioni di siero aliquotati nelle strisce di provette per PCR a -80 °C fino al momento dell'uso.
- Un giorno prima dell'esecuzione del test HI, scongelare le aliquote del campione di siero di interesse a temperatura ambiente.
- Aggiungere 10 μl dell'antisiero appropriato in una provetta PCR vuota.
nota: Per fungere da controllo positivo, l'antisiero contro un virus specifico deve corrispondere al virus utilizzato. Il controllo positivo consente la standardizzazione delle prestazioni delle lastre su più piastre.
- Aggiungere 30 μL di soluzione di filtrato di colera a ciascuna aliquota sierica e all'antisiero (3 volumi di filtrato di colera per 1 volume di siero) utilizzando una pipetta multicanale.
- Conservare le provette per PCR in un rack PCR da 96 pozzetti o in una scatola di puntali vuota e vorticare per 5 s.
- Incubare i campioni per una notte a 37 °C utilizzando un termociclatore.
- Incubare i campioni a 56 °C per 30 minuti per inattivare il filtrato di colera utilizzando un termociclatore.
nota: A seconda del termociclatore, questa fase può essere programmata per automatizzare ulteriormente il processo.
- Conservare le provette per PCR in un rack PCR da 96 pozzetti o in una scatola di puntali vuota e vorticare per 5 s.
- Conservare i campioni a 4 °C in frigorifero fino al momento dell'uso per il test HI.
- HI assay
nota: Per un'illustrazione del principio del saggio HI vedere la Figura 1. A seconda del virus, per il test vengono utilizzate diverse specie di globuli rossi (Tabella 1). Le diverse specie di globuli rossi sono utilizzate in vari tipi di piastre a 96 pozzetti e il tempo di incubazione e l'aspetto delle cellule non agglutinate differiscono (Tabella 2). Per il test HI, 4 unità di HA di virus o antigene vengono aggiunte alla serie di diluizione a 2 volte dei campioni.
- Preparazione della soluzione antigenica
- Calcolare il volume di soluzione antigenica necessaria in base al numero di piastre da 96 pozzetti utilizzate (25 μL di antigene per pozzetto × 96 = 2.400 μL di antigene per piastra da 96 pozzetti; aggiungere 100 μL per piastra in più a causa dell'utilizzo di un serbatoio per la pipetta multicanale; un totale di 2,5 mL di antigene per piastra).
nota: Ad esempio, se si misurano 100 campioni di siero, sono necessarie 10 piastre (10 campioni per piastra): 2,5 mL x 10 = 25 mL di soluzione antigenica necessari in totale.
- Preparare la diluizione appropriata di 4 unità HA per il volume calcolato utilizzando PBS.
NOTA: Per il test HA vengono determinate 4 unità HA. Per la quantità appropriata di antigene, dividere il volume calcolato per il titolo corrispondente a 4 unità di HA. Ad esempio, 4 unità di HA corrispondono a una diluizione di 1/64 e sono necessari 15.000 μL di soluzione di antigene: 15.000/64 = vengono aggiunti 234,4 μL dell'antigene influenzale liofilizzato disciolto.
- Preparazione della sospensione RBC
- Calcolare il volume di sospensione di globuli rossi necessario in base al numero di piastre per microtitolazione a 96 pozzetti utilizzate (50 μl di sospensione di globuli rossi per pozzetto × 96 = 4.800 μl di sospensione di globuli rossi per piastra a 96 pozzetti; aggiungere 200 μl per piastra in più a causa dell'utilizzo di un serbatoio per la pipetta multicanale).
- Diluire la sospensione madre di globuli rossi (normalmente 10%, v/v; eccetto il tipo O umano) con PBS per ottenere le concentrazioni corrette per i globuli rossi aviari e mammiferi, rispettivamente dello 0,75% e dell'1%.
- Preparazione della piastra per microtitolazione a 96 pozzetti
- Etichettare le piastre per microtitolazione a 96 pozzetti (ID del campione, controllo positivo e titolazione inversa). Si prega di controllare attentamente l'orientamento della piastra nella Figura 5.
- Aggiungere 25 μl di PBS a ogni pozzetto, ad eccezione del primo pozzetto della riga di "titolazione inversa" (Figura 5,12a fila) utilizzando la pipetta multicanale.
nota: È stata eseguita una titolazione inversa per verificare se la diluizione dell'antigene utilizzato è pari a 4 unità HA. Un titolo dell'antigene di 4 unità di HA è indicato se l'emoagglutinazione si verifica nei primi tre pozzetti della fila di "titolazione a ritroso", ma non nel quarto pozzetto.
- Aggiungere 50 μl della soluzione di antigene preparata (descritta al punto 5.2.1) nel primo pozzetto della riga di "titolazione a ritroso" (12a fila).
- Aggiungere 25 μl di campioni di siero trattati con RDE ai primi pozzetti delle file da 1 a 10 di ciascuna piastra, utilizzando la pipetta multicanale.
- Aggiungere 25 μl dell'antisiero appropriato al primo pozzetto dell'11a fila come controllo positivo.
- Eseguire diluizioni seriali di 2 volte trasferendo 25 μl dal primo pozzetto di ciascuna fila (1 - 12) ai pozzetti successivi utilizzando una pipetta multicanale. Miscelare pipettando su e giù 10-15 volte per ogni fase di diluizione. Gli stessi puntali possono essere utilizzati per ogni fase di diluizione per campione.
- Scartare gli ultimi 25 μl degli ultimi pozzetti.
- Aggiungere 25 μl della soluzione antigenica utilizzando una pipetta multicanale a ciascun pozzetto delle file da 1 a 11 (campioni di siero e antisiero). Le stesse punte possono essere utilizzate se non toccano i pozzetti.
- Aggiungere 25 μl di PBS al posto dell'antigene a ciascun pozzetto della riga di "titolazione inversa" (12a fila).
- Picchiettare con cura il piatto 10 volte su tutti e quattro i lati per mescolare.
- Coprire la piastra con un coperchio e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Non spostare la piastra durante l'incubazione.
- Aggiungere 50 μl di sospensione di globuli rossi a ogni pozzetto.
- Picchiettare attentamente il piatto 10 volte su tutti e 4 i lati per mescolare.
- Coprire la piastra con un coperchio e incubare a temperatura ambiente per il periodo di tempo appropriato a seconda delle specie di globuli rossi utilizzate (vedere Tabella 2). Non spostare la piastra durante l'incubazione.
- Lettura della targa
nota: Il titolo HI è il reciproco dell'ultima diluizione del (anti-) siero che inibisce completamente l'emoagglutinazione. È importante considerare che i sieri trattati con RDE erano già diluiti 1:4 e dopo la fase di diluizione seriale, i sieri nei primi pozzetti vengono diluiti 1:8, che corrisponde a un titolo HI di 8.
- Lettura dei globuli rossi aviari
- Inclinare la piastra di 90° per 25 s.
nota: L'inclinazione della piastra è fondamentale per la differenziazione dei modelli aviari perché tutti e tre i diversi tipi di modelli di agglutinazione (completamente agglutinato, parzialmente agglutinato e non agglutinato) appaiono come un pulsante quando non inclinati.
- Contrassegnare immediatamente i risultati, mentre la piastra è ancora in posizione inclinata, su uno schema stampato della piastra a 96 pozzetti. I modelli di agglutinazione dei globuli rossi aviari sono mostrati nella Figura 3.
Tabella 1: Antigeni influenzali e specie corrispondenti di globuli rossi. Secondo le istruzioni del produttore (NIBSC).
| Antigene dell'influenza | A/California/7/09 (H1N1) | A/Svizzera/9715293/2013 (H3N2) | A/Texas/50/2012 (H3N2) | B/Brisbane/60/08 | B/Massachusetts/02/2012 |
| Specie di globuli rossi | pollo | cavia | cavia | Turchia | Turchia |
Tabella 2: Condizioni di analisi con diverse specie di globuli rossi.Secondo il protocollo dell'OMS. (* scorre quando inclinato).
| Specie di globuli rossi | pollo | Turchia | cavia | Tipo umano O |
| Concentrazione di globuli rossi (v/v) | 0,75% | 0,75% | 1% | 1% |
| Tipo di piastra per microtitolazione | Fondo a V | Fondo a V | U in basso | U in basso |
| Tempo di incubazione, RT | 30 minuti | 30 minuti | 1 ora | 1 ora |
| Comparsa di cellule non agglutinate | bottone* | bottone* | alone | alone |
