$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Polarizzazione di HMDM
- In condizioni sterili, preparare il terreno di priming M1 aggiungendo interferone γ (IFNγ; 20 ng/mL) e lipopolisaccaride (LPS; 1 μg/mL) al terreno di coltura RPMI-1640 completo. Preparare il terreno di priming M2 aggiungendo interleuchina 4 (IL-4; 20 ng/mL) al terreno di coltura RPMI-1640 completo.
- In condizioni sterili, aspirare i terreni dai pozzetti della piastra di coltura tissutale che contengono i macrofagi derivati da monociti umani, HMDM, che sono stati seminati e coltivati come descritto nella sezione 1.
- Lavare accuratamente i pozzetti contenenti le cellule 3 volte con PBS sterile (preriscaldato a 37 °C), utilizzando aliquote da 1 mL di PBS.
- Aggiungere 1 mL del terreno di priming M1 o M2 a ciascun pozzetto contenente l'HMDM (a seconda di quale sia appropriato per l'esperimento).
- Incubare le cellule per 48 ore a 37 °C in presenza del 5% di CO2 in un incubatore cellulare.
2. Stimolazione dell'HMDM per indurre il rilascio di MET
- In condizioni sterili, preparare i terreni di coltura contenenti diversi stimolatori delle trappole extracellulari dei macrofagi Rilascio di MET (a seconda di quale sia appropriato per l'esperimento) nei terreni RPMI-1640 completi: PMA (25 nM), TNFα ricombinante umano (25 ng/mL) o IL-8 ricombinante umano (50 ng/mL).
- Per esperimenti con acido ipocloroso, stimolazione di HOCl, preparare HOCl (200 μM) in HBSS (preriscaldato a 37 °C), immediatamente prima dell'aggiunta alle cellule. Assicurarsi che l'HOCl non sia preparato in un terreno cellulare completo.
nota: La concentrazione della soluzione madre di HOCl viene quantificata misurando l'assorbanza UV della soluzione a 292 nm e pH = 116 e utilizzando un coefficiente di estinzione di 350 M-1 cm-1.
- Dopo il trattamento di polarizzazione descritto nella sezione 2, aspirare il terreno cellulare da ciascun pozzetto e lavare accuratamente le cellule 3 volte con aliquote da 1 mL di: PBS sterile (per PMA, TNFα e IL-8) o HBSS (per HOCl), che sono state preriscaldate a 37 °C.
- Per gli esperimenti con PMA, TNFα o IL-8: aggiungere 1 mL del terreno completo contenente PMA, TNFα o IL-8 dopo aver rimosso il PBS nella fase finale di lavaggio.
- Per gli esperimenti con TNFα, incubare le cellule per 6 ore a 37 °C in presenza del 5% di CO2 in un incubatore cellulare. Per gli esperimenti con PMA e IL-8, incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in presenza del 5% di CO2 in un incubatore cellulare.
- Per gli esperimenti con HOCl, aggiungere 1 ml di HOCl in HBSS dopo aver rimosso l'HBSS nella fase finale di lavaggio. Quindi, incubare le cellule per 15 minuti a 37 °C in presenza del 5% di CO2 in un incubatore cellulare.
- Aspirare con cautela il surnatante cellulare e lavare le cellule 3 volte con aliquote da 1 mL di HBSS come descritto al punto 2.3.
- Dopo aver rimosso l'HBSS dalla fase finale di lavaggio, aggiungere 1 mL di terreno di coltura RPMI-1640 completo. Quindi, incubare le cellule per 24 ore a 37 °C in presenza del 5% di CO2 in un incubatore cellulare.
3. Visualizzazione di MET in coltura cellulare viva
- Preparare il colorante verde SYTOX in HBSS a una concentrazione di 40 μM.
- Al termine dei trattamenti descritti nella sezione 2 per indurre il rilascio di MET, aggiungere direttamente 25 μL di 40 μM di colorante a ciascun pozzetto contenente HMDM.
- Incubare le cellule a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti al buio.
- Posizionare l'HMDM in pozzetti di coltura tissutale sul tavolino del microscopio di un microscopio a fluorescenza invertita per l'imaging.
- Procedure al microscopio
- Accendere una sorgente luminosa fluorescente ad ampio spettro, una sorgente luminosa in campo chiaro e un microscopio invertito installati con una fotocamera digitale a colori ad alta risoluzione (vedere Tabella dei materiali).
- Ruotare la ruota del filtro sulla posizione "numero 2" per la fluorescenza verde (eccitazione = 504 nm, emissione = 523 nm) per l'imaging dei campioni colorati in verde contenuti all'interno dei pozzetti di coltura tissutale.
- Utilizzando l'obiettivo 5x, mettere a fuoco l'immagine con la messa a fuoco grossolana, quindi le manopole di messa a fuoco fine sul microscopio, fino a quando l'immagine appare nitida, chiara e a fuoco se osservata attraverso l'oculare del microscopio.
- Passare il microscopio alla modalità fotocamera.
- Avviare il software associato.
- Seleziona la scheda Cattura sul software.
- Fare clic sul pulsante Riproduci per visualizzare l'anteprima dell'immagine e regolare la manopola di messa a fuoco fine sul microscopio fino a quando l'immagine non appare nitida, chiara e messa a fuoco nella finestra di anteprima del software.
- Fare clic sul pulsante Acquisisci.
nota: L'immagine acquisita verrà automaticamente visualizzata nel software di accompagnamento.
- All'interno del software, fare clic su File | Salva come tipo di file immagine richiesto.
- Sul microscopio, ruotare la ruota portafiltri sulla posizione "numero 5" per l'imaging in campo chiaro e ripetere i passaggi da 3.5.2 a 3.5.9 per ottenere l'immagine in campo chiaro corrispondente.
- Ripetere i passaggi 3.5.2–3.5.10 se necessario per la successiva acquisizione dell'immagine.