Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Purificazione di leucociti polimorfonucleati umani e isolamento di siero umano
NOTA: Tutti i reagenti devono essere controllati regolarmente per la presenza di endotossina utilizzando un kit di rilevamento di endotossine disponibile in commercio e devono contenere <25,0 pg/mL di endotossina per prevenire l'innesco indesiderato di PMN.
- Portare a temperatura ambiente 50 mL di 3% destrano-0,9% NaCl (p/v), 35 mL di NaCl 0,9% (p/v), 20 mL di NaCl all'1,8% (p/v), 12 mL di soluzione a gradiente di densità da 1,077 g/mL e 20 mL di acqua per iniezione o irrigazione.
- Per isolare il siero umano, incubare 4 mL di sangue umano appena prelevato senza anticoagulante a 37 °C in una provetta di vetro da 15 mL per 30 min. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 2.000-3.000 × g per 10 minuti a temperatura ambiente. Trasferire lo strato superiore di siero in una provetta da centrifuga conica fresca da 15 ml e metterla sul ghiaccio.
- Combinare 25 mL di sangue umano intero eparinizzato appena prelevato (1000 unità/mL) con 25 mL di Destrano al 3% e 0,9% NaCl a temperatura ambiente (rapporto 1:1) in due provette da centrifuga coniche replicate da 50 mL (50 mL di volume totale per provetta). Mescolare facendo oscillare delicatamente ogni provetta conica da 50 mL e poi lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione a temperatura ambiente, appariranno due strati separati. Trasferire lo strato superiore di ciascuna miscela di destrano e sangue in nuove provette coniche da 50 ml e centrifugare a 450 x g per 10 minuti a temperatura ambiente con freni bassi o assenti.
- Aspirare con cura entrambi i surnatanti e scartarli senza disturbare i pellet cellulari. Risospendere delicatamente ogni pellet cellulare in 2 mL di NaCl 0,9% a temperatura ambiente, combinare i pellet risospesi in una singola provetta conica da 50 mL, quindi aggiungere il restante 0,9% di NaCl (volume finale di 35 mL).
- Applicare accuratamente 10 mL di soluzione a gradiente di densità a temperatura ambiente di 1,077 g/mL sotto la sospensione cellulare utilizzando una pipetta manuale. Centrifugare a 450 x g per 30 min a temperatura ambiente con freni bassi o assenti. Aspirare delicatamente il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Il surnatante conterrà cellule mononucleate del sangue periferico che possono essere raccolte come descritto in precedenza.
- Lisi i globuli rossi risospendendo il pellet cellulare in 20 ml di acqua a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente facendo oscillare il tubo per 30 secondi. La lisi dei globuli rossi sarà accompagnata da una netta diminuzione della torbidità.
- Aggiungere immediatamente 20 mL di NaCl all'1,8% (a temperatura ambiente [RT]) e centrifugare il campione a 450 × g per 10 minuti a temperatura ambiente.
nota: È importante ridurre al minimo il tempo in cui i PMN vengono lasciati in acqua da soli dopo la lisi dei globuli rossi per massimizzare la resa di PMN e prevenire la lisi e/o l'attivazione dei PMN.
- Aspirare con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Risospendere delicatamente il pellet di cella in 2 mL di terreno RT RPMI 1640 e metterlo sul ghiaccio.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Risospendere i PMN purificati a una concentrazione di 1 x 107 cellule/mL con RPMI ghiacciato e tenerli in ghiaccio.
- Combinare 100 μl di PMN purificati (1 x 106 cellule) con 300 μl di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) ghiacciata contenente 1 μl di colorante di ioduro di propidio in due provette per citometria a flusso replicate. Per un controllo positivo del danno alla membrana plasmatica, aggiungere 40 μl di soluzione di Triton X-100 allo 0,5% in una delle provette per citometria a flusso e mescolare accuratamente.
- Utilizzare la citometria a flusso per misurare la dispersione diretta, la dispersione laterale e la colorazione con ioduro di propidio (massimi di eccitazione/emissione a 535/617 nm) di cellule purificate (Figura 1).
nota: L'analisi di dispersione diretta e laterale identificherà le popolazioni indesiderate di linfociti e monociti. Lo ioduro di propidio colora solo le cellule con una membrana plasmatica compromessa e non devono essere utilizzati PMN purificati che hanno popolazioni pronunciate di cellule positive allo ioduro di propidio. Per questi studi, i PMN purificati sono stati utilizzati solo se comprendevano il >98% di cellule purificate e il <5% di cellule colorate positive per lo ioduro di propidio.
- Preparare una piastra a 96 pozzetti per i saggi di citotossicità PMN rivestendo i singoli pozzetti che verranno utilizzati in questo test con 100 μl di siero umano isolato al 20% che è stato diluito con DPBS.
nota: La placcatura dei PMN direttamente su plastica o vetro causerà l'attivazione delle celle. Assicurati di includere almeno un pozzetto di controllo negativo che riceverà solo i media e almeno un pozzetto di controllo positivo che riceverà lo 0,05% di Triton X-100.
- Incubare la piastra a 37 °C per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare due volte i pozzetti rivestiti con DPBS ghiacciato per rimuovere il siero in eccesso. Picchiettare delicatamente la piastra a testa in giù per rimuovere eventuali residui di DPBS e posizionarla sul ghiaccio.
- Aggiungere delicatamente 100 μL di PMN umani purificati a 1 x 107 cellule/mL a ciascun pozzetto rivestito (1 x 106 PMN/pozzetto). Lasciare che i PMN si depositino nei pozzetti incubando la piastra su ghiaccio per almeno 5 minuti. Mantenere la piastra in piano per consentire una distribuzione uniforme delle cellule in ogni pozzetto e lasciarla sul ghiaccio per evitare l'attivazione indesiderata dei PMN.
2. Saggio di citotossicità delle proteine extracellulari di S. aureus contro leucociti polimorfonucleati umani
- Coltura di S. aureus per una notte in brodo di soia triptico (TSB) utilizzando un'incubatrice con agitazione impostata a 37 °C. Per questi studi, 20 mL di TSB in fiasche di Erlenmeyer separate da 150 mL sono state inoculate con colture congelate di ceppi di S. aureus USA300 o USA300ΔsaeR/S e coltivate per circa 14 ore con agitazione a 250 giri/min.
- Sottocoltura di S. aureus eseguendo una diluizione 1:100 della coltura batterica notturna con terreni freschi. Incubare a 37 °C agitando fino a quando i batteri raggiungono la fase di crescita stazionaria precoce.
nota: Per questi esperimenti, 20 mL di brodo di soia triptico in fiasche di Erlenmeyer da 150 mL sono state inoculate con 200 μL di USA300 o USA300ΔsaeR/S coltivate durante la notte e incubate a 37 °C con agitazione a 250 giri/min per 5 ore.
- Quando i batteri hanno raggiunto la fase iniziale di crescita stazionaria, trasferire 1 mL di S. aureus in subcoltura in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugare a 5.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una siringa da 3 mL. Far passare i surnatanti attraverso un filtro da 0,22 μm e in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL su ghiaccio.
- Eseguire diluizioni seriali di surnatanti con terreni ghiacciati utilizzati per la coltura di S. aureus.
nota: Per gli esperimenti mostrati, i surnatanti di USA300 e USA300ΔsaeR/S sono stati sottoposti a quattro diluizioni consecutive di 1/2 log con TSB ghiacciato.
- Aggiungere delicatamente campioni di surnatante o terreni da soli (per controlli negativi e positivi) ai singoli pozzetti di piastre da 96 pozzetti contenenti PMN su ghiaccio dal passaggio 1.15. Per questi esperimenti, a ciascun pozzetto sono stati aggiunti 10 μL di campioni di surnatantesaeR/S USA300 o USA300Δ. Agitare delicatamente la piastra per distribuire i surnatanti nei pozzetti e incubare a 37 °C.
- All'ora desiderata, togliere la piastra dall'incubatrice e posizionarla sul ghiaccio. Aggiungere 40 μl di Triton X-100 allo 0,5% nel pozzetto del controllo positivo.
- Pipettare delicatamente i campioni su e giù in ciascun pozzetto per rimuovere completamente tutti i PMN aderiti alla piastra, quindi trasferire i campioni in provette per citometria a flusso su ghiaccio che contengono 300 μL di DPBS ghiacciato con 1 μL di ioduro di propidio.
- Misurare la proporzione di PMN positivi allo ioduro di propidio utilizzando la citometria a flusso (Figura 2A). Quando legato al DNA, lo ioduro di propidio ha eccitazione/emissione a 535/617 nm.
