Saggio di citotossicità di ceppi di Staphylococcus aureus su neutrofili dopo fagocitosi

In questo articolo

Abstract

Fonte: Dankoff, J. G. et al., Quantificazione della citotossicità di Staphylococcus aureus contro i leucociti polimorfonucleati umani. J. Vis. Exp. (2020)

In questo video, dimostriamo un test per rilevare la citotossicità di ceppi virulenti e meno virulentidi S taphylococcus aureus contro neutrofili umani dopo fagocitosi utilizzando la citometria a flusso.

Protocollo

1. Test di citotossicità di S. aureus contro leucociti polimorfonucleati umani dopo fagocitosi

NOTA: Le curve di crescita definite dalla densità ottica a 600 nm (OD600) e dalla concentrazione di batteri devono essere determinate empiricamente per i ceppi di S. aureus da testare prima di iniziare questo test. Il successo di questi esperimenti richiede la raccolta costante di concentrazioni uguali di ciascun ceppo di S. aureus testato nella fase di crescita esponenziale media utilizzando l'OD600 di batteri sub-coltivati.

Iniziare le colture notturne dei ceppi di S. aureus e dei batteri di sottocoltura come descritto di seguito.
1. Coltura di S. aureus per una notte in brodo di soia triptico (TSB) utilizzando un'incubatrice con agitazione impostata a 37 °C. Per questi studi, 20 mL di TSB in fiasche di Erlenmeyer separate da 150 mL sono state inoculate con colture congelate di ceppi di S. aureus USA300 o USA300ΔsaeR/S e coltivate per circa 14 ore con agitazione a 250 giri/min.
2. Sottocoltura di S. aureus eseguendo una diluizione 1:100 della coltura batterica notturna con terreni freschi. Incubare a 37 °C agitando.
Raccogliere S. aureus in subcoltura quando ha raggiunto la crescita esponenziale media trasferendo 1 mL di batteri in coltura in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e centrifugando a 5.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
nota: Nelle nostre condizioni di crescita, USA300 e USA300ΔsaeR/S hanno raggiunto la fase di crescita esponenziale media dopo circa 135 minuti di incubazione.
Lavare S. aureus dopo la centrifugazione aspirando il surnatante, risospendendo i batteri pellettati in 1 mL di DPBS, agitando il campione per 30 s e centrifugando a 5.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
Opsonizzare S. aureus risospendendo il pellet batterico in 1 mL di siero umano al 20% diluito con DPBS e incubando a 37 °C con agitazione per 15 min.
Centrifugare i batteri opsonizzati a 5.000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Lavare S. aureus dopo la centrifugazione aspirando il surnatante, risospendendo i batteri pellettati in 1 mL di DPBS e quindi agitando il campione fino a quando il pellet batterico non è completamente rotto più altri 30 secondi. Centrifugare i batteri a 5.000 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.
Risospendere i ceppi di S. aureus opsonizzati in 1 mL di RPMI, agitare il campione fino a quando il pellet batterico non è completamente rotto e quindi per altri 30 s. Posizionare i batteri sul ghiaccio.
Diluire i ceppi di S. aureus opsonizzati alla concentrazione desiderata con RPMI ghiacciato. Vorticare per 30 s e mettere sul ghiaccio.
Confermare la concentrazione di S. aureus opsonizzato mediante diluizioni seriali 1:10 di batteri su agar di soia triptica.
nota: Poiché le differenze nella concentrazione dei batteri utilizzati in questo test possono avere un impatto importante sulla successiva permeabilità della membrana plasmatica PMN (Figura 1A), è essenziale che la concentrazione di ciascun ceppo testato sia determinata per ogni esperimento e sia equivalente tra i ceppi.
Aggiungere delicatamente 100 μL/pozzetto di ciascun ceppo di S. aureus o RPMI (per controlli positivi e negativi) ai PMN nella piastra a 96 pozzetti su ghiaccio. Scuotere delicatamente la placca per distribuire S. aureus nei pozzi.
Sincronizzare la fagocitosi centrifugando la piastra a 500 × g per 8 minuti a 4 °C. Incubare la piastra a 37 °C immediatamente dopo la centrifugazione (T = 0).
All'ora desiderata, togliere la piastra dall'incubatrice e posizionarla sul ghiaccio. Aggiungere 40 μl di Triton X-100 allo 0,5% nel pozzetto del controllo positivo.
Pipettare delicatamente i campioni su e giù in ciascun pozzetto per estrarre completamente tutti i PMN aderiti alla piastra, quindi trasferire i campioni in provette per citometria a flusso su ghiaccio contenente 200 μL di DPBS ghiacciato con 1 μL di ioduro di propidio.
Analizza i campioni per la colorazione con ioduro di propidio utilizzando la citometria a flusso.
Misurare la proporzione di PMN positivi allo ioduro di propidio utilizzando la citometria a flusso. Quando legato al DNA, lo ioduro di propidio ha eccitazione/emissione a 535/617 nm.

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Risultati

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Figura 1: Analisi in citometria a flusso delle PMN dopo fagocitosi di S. aureus. (A) La proporzione di PMN positivi allo ioduro di propidio 90 minuti dopo la fagocitosi di diverse concentrazioni di USA300 o USA300∆saeR/S. (B) La concentrazione di ceppi opsonizzati di S. aureus utilizzati per gli esperimenti è mostrata nel pannello A. I dati sono presentati c...