Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Ceppi e condizioni colturali
Nota: in questo studio viene utilizzato il ceppo CDC1551 di M. tuberculosis, ma qualsiasi ceppo di M. tuberculosis può essere utilizzato allo stesso modo.
- Far crescere i batteri in M-OADC-TW (brodo 7H9 integrato con glicerolo allo 0,5%, destrosio all'acido oleico al 10% senza catalasi e Tween-80 allo 0,05%) a una temperatura di 37 °C fino a un OD600 di 0,5 (~ 0,2 x 107 unità formanti colonie o CFU).
- Diluire la coltura in M-OADC-TW (serie di diluizioni 1:10 dei batteri). Piastra le diluizioni dei batteri (10,5, 10,6, 10,7, 10,8) in triplicato su piastre selettive 7H11 per consentire la determinazione delle CFU.
- Incubare le piastre per quattro settimane a 37 °C o fino a quando le colonie possono essere contate con precisione.
- Centrifugare l'inoculo batterico a 8,534 x g per 5 minuti per ottenere un pellet. Lavare il pellet una volta con 10 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) e risospendere il pellet in 15 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl).
2. Infezione da aerosol di topi utilizzando una camera di Madison
- Consenti ai topi di acclimatarsi al nuovo ambiente per una settimana.
- Pesare i topi prima di caricarli nella camera.
- Collegare tre cavi alla ciabatta: l'alimentazione della camera principale, la pompa del vuoto e il compressore d'aria, in quest'ordine.
- Svitare con cautela il barattolo di vetro. Portare il barattolo di vetro nella cabina di biosicurezza e aggiungere l'inoculo di prova sospeso in 15 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) per ottenere ~ 104 - 106 CFU di batteri nei polmoni.
- Chiudere il coperchio del barattolo di vetro nella camera di biosicurezza. Collegare il barattolo all'unità nebulizzatore e regolare il tubo verticale in acciaio inossidabile in modo che l'estremità inferiore (di aspirazione) sia circa un quarto di pollice al di sotto del livello del fluido nel barattolo.
- Carica tutti gli animali necessari per l'esperimento (la camera può contenere fino a 90 topi) nella camera e chiudi tutti i fermi della porta.
- Controllare il flussometro principale (ambiente). Assicurarsi che il centro del galleggiante (sfera) scorra a circa 50 L/min come misurato sulla scala a sinistra.
- Premere il pulsante Start sul pannello di controllo della camera. Impostare la portata d'aria attraverso il flussometro del compressore (il misuratore più piccolo a sinistra) su 4 L/min sulla scala. Controllare visivamente per assicurarsi che l'inoculo di provocazione venga nebulizzato.
- Dopo 15 minuti, quando compare la luce rossa sulla parte anteriore del pannello di controllo e un segnale acustico indica la fine della corsa, premere il pulsante Reset nell'angolo in basso a destra del pannello di controllo per azzerare i timer.
- Tenere premuto il piccolo pulsante rosso sullo sportello della camera per rilasciare il vuoto.
- Aprire lo sportello della camera e rimuovere gli animali. Rimetti i topi nelle loro gabbie.
- Rimuovere il barattolo del nebulizzatore di vetro e metterlo in un contenitore di trasporto sigillato e a prova di perdite. Posizionare il contenitore all'interno della cabina di biosicurezza e gettare la sospensione di sfida in un contenitore per rifiuti designato.
- Posizionare il barattolo del nebulizzatore usato all'interno di un sacchetto a rischio biologico e sigillare il sacchetto per il trasporto in autoclave.
- Al termine della procedura di infezione, spruzzare l'interno della camera con fenolo tamponato ed etanolo al 70% e lasciare riposare la camera per 10 minuti.
- Quindi, pulire accuratamente tutte le superfici interne accessibili. Smaltire tutti gli asciugamani di carta contaminati, ecc. nella spazzatura a rischio biologico. Autoclavare in autoclave la spazzatura, i contenitori dei rifiuti e i barattoli del nebulizzatore usati.
- Riposizionare gli animali nella stanza di contenimento fino al momento dell'imaging.
- Il giorno dell'imaging, trasferire gli animali in un contenitore secondario nella sala di imaging.
3. Anestesia animale
- Anestetizzare i topi con isoflurano utilizzando un sistema di anestesia gassosa personalizzato.
- Pesare ciascuno dei due contenitori del filtro al carbone situati sulla parte superiore dell'unità di anestesia.
- Sostituire con una nuova tanica se il peso è superiore di 50 g rispetto al peso iniziale.
- Controllare l'unità di vaporizzazione per garantire una quantità sufficiente di isoflurano per la procedura.
- Posizionare il supporto del cono all'interno della camera di imaging. Posizionare il numero di coni per il naso necessari per la procedura e sigillare le aperture rimanenti con i bloccanti del cono del naso.
- Attivare l'alimentazione di ossigeno dalla bombola ad alta pressione e impostarla a 55 psi.
- Accendere la pompa di evacuazione situata davanti all'unità di anestesia e impostarla su 8 L/min.
- Attivare l'interruttore dell'ossigeno situato davanti all'unità di anestesia.
- Attivare il flusso di gas verso la camera di induzione dell'anestesia per impostare il flusso di gas a 1,5 L/min. Disattivare il flusso di gas.
- Attivare il flusso di gas verso la camera di imaging per impostare il flusso di gas a 0,25 L/min. Disattivare il flusso di gas.
- Accendi il vaporizzatore di isoflurano e impostalo al 2 - 2,5%. Regolare il livello di isoflurano in base al numero e al peso degli animali utilizzati per l'esperimento ruotando la manopola sul vaporizzatore di isoflurano (2 - 2,5% per un topo del peso di ~20 g; 4% per un porcellino d'India del peso di 300 g).
- Metti i topi nella camera di anestesia e chiudi il coperchio. Attivare il flusso di gas verso la camera di induzione dell'anestesia.
- Lasciare i topi nella camera di induzione dell'anestesia per 5-10 minuti fino a quando non sono completamente anestetizzati.
- Una volta che i topi sono stati anestetizzati, applicare un unguento ottico sugli occhi per proteggerli durante l'imaging.
- Posizionare i topi in decubito ventrale o sternale in modo tale che i loro nasi siano posizionati nel cono nasale per facilitare l'anestesia dei topi durante la procedura di imaging.
4. Imaging a fluorescenza enzimatica reporter (REF)
- Iniettare il substrato (20 μM, 2,5 μL/g di peso) mediante iniezione intraperitoneale nei topi infetti e nei topi di controllo. I topi sono sotto anestesia all'interno della camera di imaging per meno di 1 minuto.
- Avviare il sistema di imaging.
- Inizializza il sistema facendo clic su Inizializza. Attendere che la barra della temperatura diventi verde.
nota: La camera di imaging è costituita da una piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante l'imaging.
- Per l'impostazione dell'acquisizione delle immagini, selezionare Fluorescente | Trans-illuminazione per l'intero animale o Epi-illuminazione per tessuti polmonari, struttura e sovrapposizione nel pannello di controllo dell'acquisizione.
- Impostare il campo visivo su B per un singolo mouse e il livello della lampada su alto.
- Impostare il tempo di esposizione su auto, binning medio, 2 - 3 per l'f/stop, il filtro di eccitazione a 745 nm e i filtri di emissione da 780 nm a 840 nm.
- Per l'impostazione della sequenza, fare clic su Sequence Setup e selezionare 9 - 12 punti di trans-illuminazione nell'area polmonare.
- Fare clic su Acquisisci per l'acquisizione dell'immagine.
- Riposizionare il mouse nella gabbia dopo l'imaging.
- Monitorare i topi fino a quando non si sono completamente ripresi o sacrificarli per quantificare le CFU se si esegue l'imaging in un momento dell'esperimento. Esegui un punteggio di Karnofsky modificato per monitorare il benessere dei topi dopo l'imaging.
