Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Isolamento e differenziazione dei macrofagi derivati dal midollo osseo (BMM)
- Giorno 0: Sacrificare un topo femmina C57BL/6 o BALB/c di 4 - 6 settimane in una camera di CO2 e confermare la morte per lussazione cervicale. Garantire la sterilizzazione di forbici e pinze mantenendole immerse in etanolo al 70%. Spruzzare guanti con etanolo al 70% per consentire la manipolazione sterile durante tutto il processo di isolamento delle cellule del midollo osseo.
- Fissare il topo sacrificato alla tavola di dissezione fissando gli arti anteriori e disinfettandolo spruzzando abbondantemente con etanolo al 70%.
- Fai una piccola incisione (circa 1 cm) con le forbici vicino all'articolazione dell'anca. Inserisci con cura le forbici sotto la pelle per separare il muscolo sottostante e taglia la pelle intorno all'articolazione dell'anca.
nota: La tavola di dissezione può essere ruotata per consentire un migliore accesso all'articolazione dell'anca.
- Togliere accuratamente la pelle dalla gamba tirando verso la caviglia e rimuovendola. Tagliare il piede all'altezza della caviglia, facendo molta attenzione a tagliare in corrispondenza o al di sotto dell'articolazione della caviglia per lasciare la tibia completamente intatta.
nota: Il perone in questa fase è attaccato in modo lasco e può essere facilmente separato con la pinza.
- Localizzare manualmente l'articolazione dell'anca manipolando il femore per identificare il punto di rotazione. Usa con cautela le forbici per recidere la gamba sopra l'articolazione dell'anca per lasciare intatta la testa prossimale del femore.
- Rimuovere quanto più muscolo e tessuto connettivo possibile dalla gamba con le forbici. Rimuovere la pelle residua dalla caviglia e il materiale osseo in eccesso sopra l'articolazione dell'anca.
- Mettere le ossa delle gambe pulite in RPMI sterile del Roswell Park Memorial Institute integrato con penicillina/streptomicina (concentrazione finale all'1%) in una capsula di Petri su ghiaccio.
- Ripetere i passaggi da 1.4 a 1.6 per isolare la tibia e il femore dall'altra zampa posteriore.
- Rimuovere qualsiasi muscolo rimanente e tessuto connettivo dalle ossa immerse in RPMI utilizzando una pinza sterilizzata e una lama sterile #10.
- Metti le ossa sul coperchio della capsula di Petri. Tagliare con cura la tibia con la lama immediatamente sopra l'articolazione della caviglia per accedere al midollo. Rimuovere la tibia dal resto della gamba tagliando immediatamente sotto l'articolazione del ginocchio.
- Aspirare 10 ml di RPMI sterile integrato con penicillina/streptomicina (concentrazione finale all'1%) in una siringa da 10 ml e collegare un ago da 25 G.
- Tenere saldamente la tibia con una pinza, verticalmente su un tubo conico da 50 ml su ghiaccio. Utilizzare la siringa per iniettare delicatamente circa 5 mL di RPMI nell'estremità dell'osso per espellere il midollo osseo dall'altra estremità nella provetta conica. Lavare il midollo osseo con un totale di 10 ml di RPMI fino a quando l'osso diventa bianco.
nota: Dopo un accurato lavaggio, l'osso dovrebbe diventare bianco. In caso contrario, continuare a sciacquare per rimuovere il midollo. Potrebbe essere necessario tagliare l'estremità distale della tibia con la lama se è troppo stretta per inserire l'ago.
- Tagliare il femore immediatamente sopra l'articolazione del ginocchio e immediatamente sotto l'articolazione dell'anca per esporre entrambe le estremità dell'osso per accedere al midollo. Lavare il midollo osseo dal femore con un totale di 10 ml di RPMI allo stesso modo della tibia.
- Ripetere i passaggi di pulizia e lavaggio da 1,6 a 1,13 con le ossa rimanenti e raccogliere le cellule lavate con il midollo osseo in un'unica provetta conica da 50 mL
nota: Se un osso si rompe in qualsiasi momento durante la dissezione prima del lavaggio osseo, non utilizzare il midollo di questo osso.
- Centrifugare la provetta conica utilizzata per raccogliere il midollo osseo lavato da tutte e quattro le ossa per 10 minuti a 4 °C a 300 x g.
- Trasferire 60 mL di terreno sterile BMM (RPMI con una concentrazione finale del 20% di siero fetale bovino, FBS, 1% di penicillina/streptomicina, 1,2 mM di Na-piruvato, 25 μg/mL di fattore stimolante le colonie di macrofagi umani (M-CSF) in un pallone per coltura cellulare da 175 cm2 con tappo filtrante.
- Eliminare il surnatante dopo la centrifugazione e risospendere il pellet cellulare mediante pipettaggio delicato su e giù utilizzando 5 mL di terreno BMM dal pallone.
- Trasferire la sospensione cellulare nel pallone di coltura e sciacquare due volte la provetta conica con il terreno BMM dal pallone di coltura per garantire il massimo recupero cellulare. Assicurarsi che la sospensione cellulare sia accuratamente miscelata in un terreno e distribuire 30 mL dal pallone iniziale di coltura cellulareda 175 cm 2 a un secondo pallone di coltura cellulare2 da 175 cm 2 con tappo filtrante.
- Incubare entrambi i flaconi contenenti 30 mL di sospensione cellulare ciascuno per una notte a 37 °C, 5% di anidride carbonica (CO2) per consentire la separazione di eventuali fibroblasti contaminanti, macrofagi residenti e altre cellule aderenti.
- GIORNO 1: Trasferire il surnatante contenente cellule indifferenziate del midollo osseo da fiasche in piastre di Petri in polistirene non trattato con TC da 100 mm x 15 mm a circa 10 mL/piastra e incubare a 37 °C, 5% CO2.Scartare i flaconi.
- GIORNO 3 o 4: Aggiungere altri 5 mL di terreno BMM (preriscaldato a 37 °C) a ciascuna piastra di Petri e continuare l'incubazione a 37 °C, 5% di CO2.
2. Placcatura di BMM su vetrini coprioggetti per infezione (GIORNO 7 o 8)
- Preparare piastre per colture tissutali a 6 pozzetti posizionando quattro (4) vetrini di vetro sterili da 12 mm (sterilizzati in autoclave e conservati in un contenitore di vetro chiuso) sul fondo di ciascun pozzetto vuoto.
nota: Prelevare ogni vetrino coprioggetto sterile da 12 mm con una punta di aspirazione montata su una linea del vuoto. Posizionare i vetrini coprioggetti nei pozzetti senza sovrapporsi, rilasciandoli nella posizione desiderata pizzicando il tubo per interrompere il vuoto.
- Aspirare i terreni (e le cellule non aderenti) da piastre di Petri rivestite con macrofagi aderenti derivati dal midollo osseo e sciacquare delicatamente le cellule aderenti 2 volte con soluzione fisiologica tamponata con fosfato di Dulbecco sterile senza cloruro di calcio e magnesio (PBS -/-) preriscaldato a 37 °C.
- Aggiungere goccia a goccia, 5 mL di PBS -/- sterile con una concentrazione finale di 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) a ciascuna piastra di Petri e incubare per 5 minuti a 37 °C per staccare i BMM aderenti. Verificare che le cellule siano state staccate utilizzando un microscopio.
- Raccogliere tutte le cellule staccate sospese in 1x PBS -/- integrato con 1 mM di EDTA in una provetta conica da 50 mL. Sciacquare ogni piatto 2 volte con 5 mL di PBS -/- e aggiungerlo alla piscina di sospensione cellulare.
nota: La sospensione cellulare può essere diluita con ulteriore PBS -/- per proteggere i macrofagi dalla tossicità dell'EDTA durante il processo di raccolta.
- Centrifugare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere i macrofagi in un terreno BMM da 5 - 10 mL mediante pipettaggio. Posizionare le cellule risospese sul ghiaccio per evitare che si attacchino ai tubi e si formino grumi.
- Contare le cellule vitali utilizzando l'esclusione del blu di tripano nell'emocitometro.
nota: Per contare le cellule BMM risospese in 5 mL di terreno, una miscela di diluizione di 25 μL di sospensione cellulare in 445 μL di PBS -/- e 30 μL di soluzione di blu di tripano allo 0,4% consente in genere una facile quantificazione in un emocitometro (tenendo conto di un fattore di diluizione 20x per il calcolo finale). Contare solo le cellule che non sono state colorate con il blu di tripano (cellule vitali). Il volume della sospensione cellulare può essere alterato se questa miscela è troppo concentrata o diluita. In generale, la resa di BMM per preparazione varia tra 2 x 107 e 5 x 107 cellule da un singolo topo.
- Preparare la sospensione cellulare in terreno BMM alla concentrazione di placcatura desiderata (5 x 105/mL) e disperdere la sospensione in piastre a 6 pozzetti in terreno da 2 mL per pozzetto in modo che ogni pozzetto riceva 1 x 106 macrofagi.
nota: Questo è un passaggio critico che garantisce che ogni pozzetto riceva un numero adeguato di macrofagi per coprire uniformemente i vetrini. Verificare che i vetrini coprioggetti nei pozzetti non si sovrappongano o galleggino nel mezzo. In tal caso, regolare delicatamente con una punta per pipetta sterile.
- Incubare per una notte a 37 °C, 5% CO2.
3. Purificazione delle forme infettive di Leishmania amazonensis
NOTA: Prepara la Leishmania per le infezioni: purifica i promastigoti metaciclici da colture stazionarie di promastigote, o differenzia i promastigoti in coltura in forma di amastigote utilizzando il protocollo di differenziazione axenica standard di L. amazonensis.
- Purificazione dei promastigoti metaciclici di Leishmania utilizzando mezzi a gradiente di densità (Materiali)
- Preparare una soluzione madre al 40% di mezzi a gradiente di densità in acqua sterile priva di endotossine.
- Diluire la soluzione a gradiente di densità in 10x terreno M199 (senza siero) per preparare una concentrazione del 10% nel terreno M199.
- Filtrare tutte le soluzioni attraverso un filtro da 0,22 μm.
nota: Le soluzioni madre possono essere conservate a 4 °C al buio per non più di 1 mese.
- Aggiungere 2 mL di soluzione di terreno con gradiente di densità al 40% sul fondo di una provetta da centrifuga conica da 15 mL.
- Stendere accuratamente 2 mL di soluzione di terreno con gradiente di densità al 10% in M199 sopra lo strato di terreno con gradiente di densità al 40%, utilizzando una pipetta Pasteur per evitare qualsiasi miscelazione tra i due strati.
- Raccogliere 1 x 109 parassiti dalla coltura in fase stazionaria mediante centrifugazione a 1.900 x g per 10 min.
- Risospendere le cellule in 6 mL di Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM).
- Stendere 2 mL della sospensione cellulare direttamente sopra lo strato di terreno con gradiente di densità del 10%, delicatamente, utilizzando una pipetta Pasteur per evitare la miscelazione tra gli strati.
- Centrifugare il gradiente per 10 minuti a 1.300 x g a temperatura ambiente.
nota: A causa delle differenze nelle proprietà fisiche tra le specie di Leishmania, potrebbe essere necessario regolare leggermente le condizioni di centrifugazione per ciascuna di esse per garantire la massima resa.
- Raccogliere i parassiti (arricchiti in forma di promastigote metaciclico) dalla banda formata al limite superiore del gradiente di densità del 10% (interfaccia tra gli strati del gradiente di densità 0% e 10%).
- Diluire i parassiti con un volume di DMEM e raccogliere per centrifugazione (1.900 x g per 10 minuti a temperatura ambiente).
- Risospendere in 500 μL di terreno DMEM e contare in un emocitometro per quantificare la resa.
- Generazione di L. amazonensis amastigotes in condizioni di coltura axenica (pH basso / temperatura elevata)
- Miscelare 5 mL di coltura di promastigote in fase logaritmica (pH 7,4 a 26 oC) con un volume uguale di terreno amastigote (pH 4,5), utilizzando fiasche da 25 cm2 (terreno totale 10 mL) e incubare a 26 °C per una notte.
- Spostare il matraccio da 26 °C a 32 °C.
- Dopo 3 o 4 giorni, dividere la coltura 1:5 in terreno di amastigote a 32 °C.
- Controlla i parassiti nei prossimi 3 - 4 giorni (massimo 7 giorni) per vedere se sono pronti per l'uso nelle infezioni.
nota: Gli amastigoti axenici sani dovrebbero avere una forma ovale, senza flagelli visibili. Gli amastigoti parzialmente differenziati hanno una grande forma ovale con corti flagelli. La coltura non dovrebbe avere molti grumi: molti ciuffi sono un'indicazione di parassiti morenti che non crescono. La coltura dell'amastigote può essere divisa 1:5 e mantenuta per un massimo di 3 settimane.
4. Infezione da L. amazonensis
- Diluire le sospensioni antiparassitarie in base alla molteplicità di infezione (MOI) desiderata (di solito 3-5 promastigoti metaciclici per macrofago [MOI di 1:3 o 1:5] e 1 amastigote per macrofago [MOI 1:1]). Aggiungere Leishmania in PBS -/- in un volume di 50 - 100 μL a ciascun pozzetto contenente già 2 mL di terreno.
- Incubare i BMM per 1 ora con amastigoti e 3 ore con promastigoti metaciclici a 34 oC per l'infezione.
nota: La temperatura ottimale dell'infezione può variare a seconda della specie.
- Dopo l'incubazione, lavare accuratamente i parassiti liberi in ciascun pozzetto 3 volte con 2 mL di PBS -/- preriscaldato a 37 °C.
nota: Disperdere delicatamente il PBS per assicurarsi che i vetrini coprioggetti non galleggino l'uno sull'altro. Agitare delicatamente la piastra e poi aspirare il liquido. Utilizzare una punta di aspirazione separata se si utilizzano più ceppi di parassiti per evitare la contaminazione incrociata.
- Fissare i campioni di 1 ora o 3 ore di punto temporale incubando ciascun pozzetto con 1,5 - 2 mL di PFA al 2% in PBS -/- per 10 minuti. Lavare 3 volte con PBS -/-. Non aspirare l'ultimo lavaggio e conservare in frigorifero le piastre contenenti vetrini coprioggetti in PBS fino alla macchia.
- Aggiungere 2 mL di terreno BMM fresco in ciascun pozzetto su piastre per ulteriori punti temporali e incubare a 34 °C.
- Fissare i punti temporali rimanenti come descritto al punto 4.3 e conservare in frigorifero le piastre fino alla colorazione.
5. 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) Colorazione e montaggio del vetrino coprioggetti
- Aspirare il PBS dai pozzetti contenenti vetrini coprioggetti e aggiungere 1,5 mL di PBS -/- con lo 0,1% di detergente non ionico. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare 3 volte con 2 mL di PBS -/-.
- Aggiungere 1 mL di PBS -/- con 2 μg/mL di DAPI (diluito da 5 mg/mL di soluzione madre in acqua) ai pozzetti contenenti vetrini coprioggetti e incubare per un'altra 1 ora a temperatura ambiente.
nota: Il tempo di incubazione con DAPI è fondamentale per una corretta visualizzazione dei parassiti intracellulari della Leishmania. I nuclei dei macrofagi si colorano rapidamente, a causa delle loro dimensioni maggiori e del contenuto di acido desossiribonucleico (DNA), ma la colorazione dei nuclei dei parassiti intracellulari è più lenta. Pertanto, è necessario estendere il tempo di incubazione oltre ciò che è necessario per visualizzare i nuclei di BMM per consentire a DAPI di permeare attraverso la membrana plasmatica del parassita e la membrana nucleare del parassita. Con un'adeguata colorazione DAPI, è possibile visualizzare anche il DNA del cinetoplasto mitocondriale vicino alla tasca flagellare del parassita, oltre al DNA nucleare.
- Lavare ogni pozzetto contenente i vetrini coprioggetti 3 volte con 2 mL di PBS -/-, quindi sollevare e capovolgere i vetrini coprioggetti con una pinza per posizionare la cella rivolta verso il basso e montarli su vetrini da microscopio con un reagente di montaggio antisbiadimento disponibile in commercio.
nota: I vetrini coprioggetti sono estremamente fragili e richiedono una manipolazione cauta. Evitare di esercitare pressione su di essi, soprattutto contro la parete laterale dei pozzetti durante il sollevamento. L'aggiunta di alcune gocce di PBS -/- riduce la tensione superficiale tra il vetrino coprioggetti e il pozzetto e facilita il processo di sollevamento. Un ago di calibro fine può essere utilizzato per aiutare a sollevare i vetrini coprioggetti dal fondo del pozzetto. Dopo aver posizionato un vetrino coprioggetti sul vetrino, premere delicatamente con una pinza per espellere eventuali bolle d'aria nel supporto di montaggio. Se un vetrino coprioggetti è rotto o si è ribaltato durante il processo di sollevamento, non rimontare; Basta utilizzare il quarto vetrino di ricambio per la conservazione.
- Refrigerare i vetrini fino alla quantificazione.
6. Quantificazione delle infezioni
- Esaminare i vetrini colorati con DAPI al microscopio a fluorescenza concentrandosi sui macrofagi utilizzando una lente obiettivo 100X con olio da immersione (eccitazione a 358 nm; emissione ottimale a 461 nm).
Assicurarsi che l'attenzione sia rivolta allo strato di macrofagi tra il vetrino e il vetrino.
- Quantificare il numero di macrofagi (nuclei grandi colorati con DAPI) e il numero di nuclei di amastigote più piccoli raggruppati attorno a ciascun nucleo di macrofagi (vedi Figura 1A, DAPI) per ciascun campo visivo, utilizzando un contatore manuale.
nota: I nuclei di amastigote potrebbero non essere tutti visibili su un piano di fuoco a causa delle loro piccole dimensioni. Conta quelli che sono visibili quando focalizzati sui nuclei dei macrofagi, quindi usa la messa a fuoco fine per verificare la presenza di nuclei di parassiti nei piani sopra e sotto i nuclei dei macrofagi.
- Passa a un altro campo visivo per ripetere la quantificazione. Utilizzare un tasto contatore separato per tenere traccia del numero di campi conteggiati. Spostarsi tra i campi visivi in file parallele su ciascun vetrino coprioggetti, per evitare sovrapposizioni di conteggio.
- Quantificare un minimo di 200 macrofagi per vetrino coprioggetti. Quantificare ogni punto temporale dell'infezione in triplicato (3 vetrini). Contare il quarto vetrino coprioggetti se uno dei precedenti non è adatto al conteggio a causa di sovrapposizione del vetrino, montaggio inadeguato, rottura del vetro, ecc.
nota: Se non si possono contare 200 macrofagi su un vetrino coprioggetti, contate il quarto di riserva.
- Calcola i tassi di infezione come amastigoti/macrofagi o amastigoti/100 macrofagi e determina la percentuale di macrofagi infetti dai dati grezzi di quantificazione.
