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1. Passaggio delle colture di organoidi
- Aggiungere 1 ml di terreno basale freddo alla matrice basale nel pozzetto. Utilizzando una micropipetta da 1 ml, pipettare energicamente su e giù fino a quando la matrice basale non viene frantumata. Trasferire in una provetta da 15 ml. Mettere sul ghiaccio.
- Prelevare gli organoidi nella pipetta e pipettare energicamente 10 volte su e giù. La rottura degli organoidi può essere osservata ad occhio.
2. Microiniezione di coltura di organoidi.
Nota: Questo protocollo può essere utilizzato per microiniettare batteri negli organoidi. Può essere utile iniziare l'iniezione con organoidi che sono più permissivi alla microiniezione. Ad esempio, gli organoidi gastrici di topo possono crescere in organoidi cistici molto grandi che sono facili da colpire.
- Preparazione del materiale
- Estrarre un capillare di vetro in due aghi per iniezione utilizzando un estrattore per micropipette, secondo le raccomandazioni del produttore. L'estrattore per micropipette riscalderà il capillare di vetro al centro e tirerà il capillare in due parti, generando così due aghi di vetro. È pratico estrarre diversi aghi e conservarli in una capsula di Petri pulita.
- Per consentire l'infezione batterica, rimuovere gli antibiotici da tutti i terreni per almeno 3 cambi di terreno (= una settimana). Questo diluirà gli antibiotici dalla matrice basale. Se si utilizza un ceppo batterico resistente a un antibiotico specifico, aggiungere questo antibiotico specifico per ridurre al minimo le possibilità di contaminazione.
- Preparare il banco di lavoro per le microiniezioni. Per lavorare a diversi livelli di biosicurezza, potrebbe essere necessario posizionare uno stereomicroscopio all'interno di un banco sterile. In questo protocollo, iniettare H. pylori in condizioni di biosicurezza di livello 2 sotto uno stereomicroscopio all'interno di un banco sterile.
- Coltivare i batteri secondo protocolli standard.
- Per stimare la molteplicità dell'infezione (MOI), stimare due parametri: il numero di batteri e il numero di cellule per organoide come descritto di seguito. Il MOI può essere correlato ai risultati, ad esempio con l'espressione dell'mRNA IL-8 dell'ospite.
- Per calcolare la densità batterica nella soluzione di infezione, stabilire innanzitutto la curva standard della densità ottica e delle unità formanti colonie (CFU) secondo i protocolli standard. Una densità ottica di 0,1 a 550 nm dovrebbe fornire circa 107 CFU/ml.
- Per stimare il numero di cellule per organoide, contare il numero di organoidi in 1 pozzetto. Distruggere gli organoidi come descritto nei passaggi 1.1-1.4. Dopo la centrifugazione per 5 minuti a 200 x g e 4 °C, aggiungere 1 ml di soluzione di dissociazione enzimatica e risospendere.
- Incubare a 37 °C agitando ripetutamente per 5-10 minuti. Determinare se le cellule si sono dissociate in singole cellule al microscopio (microscopio invertito come Leica DMIL con ingrandimento 10X). Se necessario, prolungare l'incubazione.
- Conta le cellule per organoide utilizzando un emocitometro e calcola il numero di cellule per organoide. Gli organoidi gastrici umani con un diametro di circa 200 μm hanno circa 4.000 cellule. L'iniezione di 0,2 μl di una soluzione batterica con 1 x 109 batteri per ml determina un MOI approssimativo di 50.
- Iniezione di organoidi.
Nota: Per la microiniezione, l'ago di vetro viene stabilizzato in un supporto, che può essere manovrato in 3 dimensioni da un micromanipolatore. Gli organoidi rimangono all'interno della matrice basale all'interno del pozzetto. A causa delle dimensioni e del posizionamento nel pozzetto, non tutti gli organoidi sono ugualmente suscettibili di iniezione. Di solito, i 30 organoidi più grandi in un pozzetto possono essere presi di mira in 5 minuti.
- Raccogli i batteri e lavali nel terreno basale secondo i protocolli standard.
- Calcolare il numero di batteri per ml in base alla densità ottica (vedere il passaggio 2.1.5.1). Diluire i batteri a 1 x 109 batteri per ml in un mezzo basale.
- Prendi un ago di vetro. Usando una pinza rompere la punta in modo che l'apertura sia larga circa 10 μm.
- Inserire l'ago nel supporto per iniezione e fissarlo al micromanipolatore.
- Prelevare circa 10 μl di soluzione batterica nell'ago.
- Posizionare una piastra a 4 pozzetti con bordi bassi contenente colture di organoidi sotto lo stereomicroscopio.
- Navigando con il micromanipolatore, mirare a un singolo organoide con l'ago. Posizionare l'ago vicino all'organoide e quindi inserire l'ago nell'organoide con un movimento rapido. Iniettare circa 0,2 μl di soluzione batterica in ciascun organoide utilizzando il microiniettore.
3. Raccogli Organoidi per Qualsiasi Analisi.
- Ad esempio, fissare gli organoidi dopo 4 ore. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 ml di formaldeide al 2% e incubare 20 minuti a RT o O/N a 4 °C. Gli organoidi possono essere processati per l'immunoistochimica secondo le procedure standard.