1. Generazione di una libreria di mutanti del trasposone Coxiella marcati con GFP
Manipolare Coxiella burnetii RSA439 NMII in un livello di contenimento di biosicurezza 2 (BSL-2) in una cappa di sicurezza microbica (MSC) in conformità con le norme locali. Se compatibile con il modello batterico utilizzato, ripetere i passaggi da 1.4.1 a 1.4.4 per aumentare la probabilità di ottenere mutanti clonali. Una tipica libreria di mutanti è composta (almeno) da un numero di mutanti che è pari a tre volte il numero di sequenze codificanti annotate nel genoma dell'organismo utilizzato.
- Preparazione dell'elettrocompetente Coxiella RSA439 NMII:
- Preparare 1x cisteina citrato acidificata medium-2 (ACCM-2): 13,4 mM di acido citrico, 16,1 mM di citrato di sodio, 3,67 mM di fosfato di potassio, 1 mM di cloruro di magnesio, 0,02 mM di cloruro di calcio, 0,01 mM di solfato di ferro, 125,4 mM di cloruro di sodio, 1,5 mM di L-cisteina, 0,1 g/L di Bacto Neopeptone, 2,5 g/L di casamino acidi, 1 g/L di metil-beta ciclodestrina, 125 ml/L di Roswell Park Memorial Institute (RPMI). Regolare il pH a 4,75 e filtrare sterilizzando (non sterilizzare in autoclave).
nota: L'ACCM-2 liquido è stabile a 4 °C per circa 1 mese.
- Inoculare 100 ml di ACCM-2 con 2 x 106 genoma equivalente (GE)/ml di Coxiella RSA439 NMII (da uno stock batterico precedentemente generato e quantificato come al punto 1.5) da stock a -80 °C e distribuire la sospensione batterica in palloni di coltura cellulare da 75 cm2 con tappi ventilati (10 - 15 ml di sospensione batterica per pallone). Coltivare per 7 giorni a 37 °C in un'atmosfera umidificata con il 5% di anidride carbonica (CO2) e il 2,5% di ossigeno (O2).
- Raggruppare la sospensione batterica risultante in provette da 50 ml e centrifugare a 3.900 x g per 1 ora a 4 °C.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 30 ml di glicerolo al 10%. Centrifugare a 3.900 x g per 1 ora a 4 °C.
- Risospendere il pellet in un volume adeguato di glicerolo al 10% (tipicamente 2 ml) e aliquotare 50 μl in provette da 500 μl. Mantenere i batteri risospesi sul ghiaccio durante l'intero processo.
nota: In questa fase, i batteri sono elettrocompetenti e un'aliquota è sufficiente per eseguire un'elettroporazione. Le sospensioni batteriche possono essere conservate a -80 °C per 6 mesi o essere utilizzate direttamente per l'elettroporazione dell'acido desossiribonucleico plasmidico (DNA).
- Elettroporazione di Coxiella competente con plasmidi codificanti trasposoni e trasposi:
- Pre-raffreddare una cuvetta per elettroporazione da 0,1 cm per 10 minuti con ghiaccio. Miscelare 50 μl di Coxiella elettrocompetente con 10 μg di plasmide trasposone e 10 μg di plasmide trasposasi. Assicurarsi che la concentrazione del plasmide sia superiore a 500 μg/ml per ridurre al minimo la diluizione del glicerolo.
- Elettroporazione utilizzando la seguente configurazione: 18 kV, 500 Ω, 25 μF. Assicurarsi che la costante di tempo risultante sia compresa tra 9 e 13 msec.
- Aggiungere immediatamente 950 μl di RPMI, risospendere i batteri elettroporati e trasferirli in una provetta con tappo a vite e conservare a temperatura ambiente.
- Prelevare 200 μl di batteri elettroporati e aggiungere 3 ml di ACCM-2 integrato con siero fetale bovino (FBS) inattivato termicamente all'1% in piastre a 6 pozzetti. Aggiungere 88 μl di dimetilsolfossido (DMSO) al volume rimanente di batteri elettroporati (per raggiungere una concentrazione finale del 10% di DMSO) e conservare a -80 °C.
NOTA: per il seguente protocollo, l'elemento trasponibile e la trasposasi sono codificati da due diversi plasmidi (pITR-CAT-GFP e pUC19-Himar1C9, rispettivamente). Entrambi i plasmidi mancano di un'origine di replicazione specifica per Coxiella, il che li rende plasmidi suicidi quando vengono elettroporati in Coxiella. Ciò garantisce inserzioni stabili dei trasposoni. L'elemento trasponibile contiene una cassetta di resistenza al cloramfenicolo sotto la regolazione del promotore di Coxiella p1169 per la selezione e il gene gfp sotto la regolazione del promotore di Coxiella p311 per marcare i mutanti generati con GFP.
- Selezione dei mutanti trasposoni:
- Incubare le piastre a 6 pozzetti inoculate come descritto sopra (1.2.4) per una notte a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 e al 2,5% di O2. Aggiungere gli antibiotici appropriati (375 μg/ml di kanamicina o 3 μg/ml di cloramfenicolo). Incubare la coltura batterica per altri 3 giorni nelle condizioni sopra descritte.
- Isolamento dei singoli mutanti:
- Preparazione di piastre solide ACCM-2 e placcatura di mutanti trasposoni Coxiella
nota: Le seguenti istruzioni si riferiscono a 1 capsula di Petri, diverse diluizioni di colture batteriche devono essere testate per valutare il volume di inoculo ottimale per l'isolamento della colonia.
- Scaldare 10,5 ml di agarosio allo 0,5% in un microonde e lasciarlo raffreddare a bagnomaria a 55 °C. Scaldare 11,25 ml di 2x ACCM-2 (pH 4,75) a 37 °C.
- Preparare l'agarosio inferiore:
- Mescolare 10 ml di agarosio fuso allo 0,5% con 10 ml di 2x ACCM-2 e aggiungere gli antibiotici appropriati (375 μg/ml di kanamicina o 3 μg/ml di cloramfenicolo).
- Versare immediatamente nella capsula di Petri. Tenere la capsula di Petri senza coperchio, lasciare raffreddare il piatto per 30 minuti e asciugarla all'aria per 20 minuti.
- Preparare l'agarosio superiore:
- Mescolare 1,25 ml di 2x ACCM-2 con 0,75 ml di acqua in una provetta di polistirene da 5 ml, aggiungere gli antibiotici appropriati (375 μg/ml di kanamicina o 3 μg/ml di cloramfenicolo) e incubare a 37 °C.
- Aggiungere la coltura batterica (in genere da 1 a 100 μl) e agitare per 5 secondi.
- Aggiungere 0,5 ml di agarosio fuso, mescolare e versare immediatamente sul fondo l'agarosio.
- Lasciare raffreddare per 20 minuti, rimettere il coperchio sulla capsula di Petri e incubare a 4 °C per 20 minuti per facilitare la solidificazione dell'agarosio.
- Asciugare all'aria per 20 minuti senza coperchio in una MSC. Coltivare le piastre a 37 °C in un'atmosfera umidificata del 5% di CO2 e del 2,5% di O2 per 6-7 giorni.
- Aggiungere il DMSO alle restanti colture batteriche per raggiungere una concentrazione finale del 10% di DMSO e conservare a -80 °C.
- Valutare la diluizione ottimale come segue: assicurarsi che le colonie abbiano un diametro compreso tra 0,5 e 1 mm e siano adeguatamente isolate per evitare contaminazioni incrociate. Scongelare le restanti colture batteriche di cui al punto 1.4.2 e la piastra alla diluizione appropriata su agar ACCM-2 come descritto ai punti 1.4.1.2 e 1.4.1.3. Incubare per 6-7 giorni come descritto al punto 1.4.1.3.5.
- Una volta che le colonie sono rilevabili, raccoglierle tagliando l'estremità di un puntale da 1 ml, prelevando il tappo contenente le colonie isolate e disperdendo la colonia pipettando 1,5 ml di ACCM-2 contenente gli antibiotici appropriati (375 μg/ml di kanamicina o 3 μg/ml di cloramfenicolo) in una piastra a 24 pozzetti. Amplificare le singole colonie per 6 giorni nelle condizioni descritte al punto 1.3.1. Il 3° giorno di incubazione, disperdere i grumi batterici pipettando ciascuna coltura.
- Conservare ciascuna sospensione mutante in provette con tappo a vite 2D con codice a barre in piastre da 96 pozzetti in DMSO al 10% a -80 °C.
- Valutazione della concentrazione batterica:
nota: Il seguente protocollo può essere applicato per ottenere le curve di crescita di mutanti batterici che si replicano in un mezzo axenico (vedi 1.4.4).
- Preparazione della curva standard:
- Preparare una soluzione madre da 2 μg/ml di DNA a doppio filamento (dsDNA) (tipicamente un plasmide casuale di dimensioni e concentrazione note) in 1x acido tris-etilendiamminotetraacetico, EDTA (TE). Preparare diluizioni seriali di 10 volte dalla soluzione madre per ottenere concentrazioni comprese tra 2 μg/ml e 2 ng/ml. Erogare 50 μl di ciascuna concentrazione in singoli pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti con pareti e fondo neri (vedere la tabella di Materiali).
- Diluire il reagente di quantificazione del dsDNA 1:200 in 1x tampone TE e aggiungere 55 μl del reagente diluito a ciascun campione nella micropiastra a 96 pozzetti. Mescolare bene con uno shaker e incubare per 2-5 minuti a temperatura ambiente, al buio.
- Misurare la fluorescenza dei campioni utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza e filtri per lunghezze d'onda standard della fluoresceina (eccitazione ~480 nm, emissione ~520 nm).
- Tracciare l'intervallo di concentrazione del plasmide rispetto alle letture dell'intensità della fluorescenza.
- Quantificazione della sospensione batterica:
- Erogare 5 μl di Triton X-100 al 10% per pozzetto in una micropiastra da 96 pozzetti con pareti e fondo neri (vedere la Tabella dei materiali). Aggiungere 50 μl di sospensioni batteriche in ciascun pozzetto e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, su un agitatore per piastre.
- Diluire il reagente di quantificazione del dsDNA 1:200 in 1x tampone TE e aggiungere 55 μl del reagente diluito a ciascun campione nella micropiastra a 96 pozzetti. Mescolare bene con uno shaker e incubare per 2-5 minuti a temperatura ambiente, al buio.
- Misurare la fluorescenza dei campioni utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza e filtri per lunghezze d'onda standard della fluoresceina (eccitazione ~480 nm, emissione ~520 nm).
- Per ottenere la concentrazione di DNA batterico, tracciare le letture della fluorescenza nel grafico ottenuto al punto 1.5.1.4. Dividi la concentrazione di DNA per la massa del genoma di Coxiella (2,2 fg) per ottenere le concentrazioni batteriche. Esprimere i risultati in Genoma Equivalente/ml.
- Scartare i mutanti che presentano un difetto di crescita significativo in ACCM-2.
2. Reazione a catena della polimerasi (PCR) della colonia di primer singolo, sequenziamento e annotazione
NOTA: Il seguente protocollo è per l'amplificazione del DNA di 96 campioni, si consiglia una pipetta multicanale per i seguenti passaggi. La purificazione su colonna di prodotti PCR mediante biglie magnetiche e il sequenziamento del DNA con un primer specifico per trasposoni (2.3) è subappaltata a una società esterna.
- Assicurarsi che il primer di amplificazione sia progettato in modo da ibridare tra 100 e 200 coppie di basi a monte della ripetizione tandem invertita (ITR), per ottenere prodotti PCR che coprono il sito di inserimento del trasposone sul genoma di Coxiella. Preparare 3 ml di miscela per PCR (1 tampone ad alta fedeltà, 200 μM di deossinucleoside trifosfato (dNTP), 1 μM di primer di amplificazione, 20 U/ml di DNA polimerasi ad alta fedeltà) e dosare 29 μl per pozzetto in una piastra PCR a 96 pozzetti impostata su ghiaccio. Trasferire 1 μl di ciascun mutante nella fase stazionaria in ACCM-2 alla miscela PCR.
- Eseguire la PCR con denaturazione iniziale (98 °C, 1 min), 20 cicli ad alta stringenza (98 °C, 10 sec; 50 °C, 30 sec; 72 °C, 90 sec), 30 cicli a bassa stringenza (98 °C, 10 sec; 30 °C, 30 sec; 72 °C, 90 sec) e 30 cicli ad alta stringenza (98 °C, 10 secondi; 50 °C, 30 sec; 72 °C, 90 sec) seguita da un'estensione finale a 72 °C per 7 min.
- Purificare i prodotti PCR utilizzando biglie magnetiche e sequenziare il DNA con un primer specifico per trasposoni. Progettare il primer specifico per il trasposone con una temperatura di fusione prevista compresa tra 50 °C e 75 °C, un contenuto di GC compreso tra il 40% e il 60 %, una lunghezza compresa tra 18 e 25 nucleotidi e un sito di ricottura a valle del sito di ibridazione del primer di amplificazione e almeno 100 paia di basi a monte della prima coppia di basi del trasposone ITR.
- Utilizzando il software di analisi delle sequenze, caricare il genoma completo e annotato di Coxiella burnetii 493 NMI. Utilizzare la funzione "allinea al riferimento" per caricare e allineare (blastn) i risultati del sequenziamento e determinare il sito di trasposizione. Scartare i mutanti che non corrispondono e/o che visualizzano letture doppie. Per monitorare la saturazione della libreria mutante, tenere traccia del verificarsi di più inserzioni di trasposoni nello stesso sito.
3. Sfida delle cellule eucariotiche con mutanti di Coxiella e monitoraggio della crescita intracellulare
NOTA: Si consiglia una pipetta multicanale per i seguenti passaggi. Le infezioni sono state eseguite in triplicato in micropiastre sterili a 96 pozzetti con pareti nere e fondo piatto trasparente. wt Coxiella burnetii che esprime GFP è stato fornito dal Dr. Robert Heinzen.
- Coltiva cellule Vero in RPMI senza rosso fenolo integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in assenza di antibiotici (Complete RPMI media).
- Il giorno prima dell'infezione, lavare le cellule Vero da un pallone di coltura cellulare confluente o sub-confluente con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
- Staccare le cellule Vero aggiungendo 1 ml di soluzione di tripsina EDTA al pallone di coltura cellulare e incubare per 3-5 minuti a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2.
- Risospendere le cellule in 10 ml di terreno RPMI completo. Contare le cellule e preparare una sospensione cellulare di10-5 cellule per ml.
- Erogare 100 μl della sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra nera a 96 pozzetti con fondo piatto trasparente.
- Centrifugare per 5 minuti a 400 x g a temperatura ambiente (RT) per facilitare l'adesione cellulare sul fondo dei pozzetti e incubare per una notte a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2.
- Scongelare le piastre da 96 pozzetti contenenti i mutanti di Coxiella a RT e diluire 150 μl di sospensione batterica in 300 μl di RPMI senza rosso fenolo e FBS in una piastra a 96 pozzetti profondi.
- Rimuovere il terreno dalla micropiastra contenente le cellule Vero ed erogare 100 μl/pozzetto di mutanti Coxiella diluiti (MOI di 100). Utilizzare il pozzetto A1 come controllo negativo (cellule non infette) e i pozzetti A2 e A3 come controlli positivi (cellule infettate da Coxiella wt che esprimono GFP a molteplicità di infezioni (MOI) di 100 e 200).
- Centrifugare la piastra per 10 minuti a 400 x g a RT utilizzando un supporto per piastra da centrifuga a tenuta di aerosol.
- Incubare a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2 per 2 ore, quindi sostituire il terreno contenente batteri con 100 μl/pozzetto di terreno RPMI fresco e completo.
- Misurare la fluorescenza GFP ogni giorno per 7 giorni utilizzando un lettore di micropiastre a fluorescenza e filtri per lunghezze d'onda standard della fluoresceina (eccitazione ~480 nm, emissione ~520 nm). Per evitare interferenze dovute alla condensa e alla dispersione del segnale nel terreno di coltura, utilizzare l'eccitazione dal basso e la registrazione delle emissioni sul lettore di micropiastre.
4. Preparazione dei campioni per l'acquisizione automatica delle immagini
NOTA: La procedura è per una piastra da 96 pozzetti, aumentare i volumi di conseguenza. I passaggi da 4.2 possono sfruttare una lavatrice per piastre.
- Il 7° giorno dopo l'infezione, rimuovere il terreno dalla piastra e sostituirlo con 50 μl/pozzetto di terreno fresco e completo contenente un colorante fluorescente permeabile alle cellule alla diluizione appropriata (di solito 1:1.000, da ottimizzare in base alla linea cellulare utilizzata). Incubare le cellule per 30 - 60 minuti a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO2.
- Sostituire il terreno con 50 μl/pozzetto di paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente (RT), quindi rimuovere il tampone contenente PFA e lavare 3 volte con PBS.
- Rimuovere il PBS ed erogare 50 μl/pozzetto di soluzione bloccante (0,5% di albumina sierica bovina, 50 mM di cloruro di ammonio, NH4Cl in PBS, pH 7,4) integrata con 0,05% di saponina. Incubare a RT per 30 min.
- Sostituire la soluzione bloccante con 40 μl/pozzetto di soluzione bloccante fresca integrata con saponina (come sopra) e con un anticorpo anti-glicoproteina-1 di membrana associata al lisosoma (anti-LAMP1) a diluizione 1:500. Incubare la piastra per 30 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione bloccante e lavare la piastra a 96 pozzetti 5 volte con 100 μl/pozzetto di PBS.
- Erogare 40 μl/pozzetto di soluzione bloccante integrata con saponina (come sopra), l'anticorpo secondario marcato in fluorescenza appropriato (alla diluizione di 1:1.000) per rivelare l'anticorpo anti-LAMP1 applicato alla fase 4.4 e con Hoechst 33258 a 5 μg/ml. Incubare la piastra per 30 minuti a RT.
- Rimuovere la soluzione bloccante e lavare la piastra a 96 pozzetti 5 volte con 100 μl/pozzetto di PBS. Lasciare il volume di PBS corrispondente all'ultimo lavaggio nella piastra a 96 pozzetti, poiché le celle fisse non devono seccarsi.
- Eseguire immediatamente l'imaging della lastra o conservarla a 4 °C, al riparo dalla luce, per una successiva analisi.
5. Acquisizione di immagini
- Acquisisci immagini nei canali GFP (488 nm, batteri), Hoechst 33258 (350 nm, nuclei delle cellule ospiti), rosso (~555 nm, marcatore della membrana cellulare) e rosso lontano (~615 nm, LAMP1) utilizzando un microscopio automatizzato per epifluorescenza dotato di un obiettivo 20X. Acquisire 21 campi indipendenti per pozzetto al fine di visualizzare un minimo di 5.000 cellule per campione. Applicare la messa a fuoco automatica utilizzando il canale dei nuclei della cellula ospite come riferimento. Quando si lavora con agenti patogeni batterici che infettano una bassa percentuale di cellule ospiti, gli utenti possono regolare il numero di campi indipendenti sottoposti a imaging per pozzetto, al fine di ottenere un minimo di 500 cellule infette da analizzare.
