I seguenti protocolli descriveranno i metodi per la coltura e lo studio dell'invasione da parte della specie anaerobia, P. gingivalis; tuttavia, questi protocolli possono essere utilizzati per un certo numero di patogeni anaerobi. Sebbene vengano utilizzati gli HUVEC, questo protocollo può essere utilizzato per altre cellule eucariotiche sia immunitarie che non immuni.
1. Uso e manutenzione della camera anaerobica
Nota: P. gingivalis è un anaerobo sensibile ai normali livelli di ossigeno presenti nell'aria ambiente. Un ambiente anaerobico controllato è vitale per la coltivazione di P. gingivalis.
- In questo caso, mantenere un'atmosfera artificiale designata come gas anaerobico misto (80% N2, 10% H2, 10% CO2) in una camera anaerobica vinilica (Figura 1A). Utilizzare una camera d'aria (Figura 1B) per trasferire gli oggetti dall'ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. La camera di compensazione funziona manualmente, spurgando due volte con gas N2 prima di introdurre il gas anaerobico miscelato.
- Utilizzare una colonna di rimozione dell'idrogeno solforato (Figura 1C) per rimuovere senza manutenzione l'idrogeno solforato indesiderato. Posizionare un deumidificatore all'interno della camera per rimuovere l'H2O creato dal catalizzatore e per evitare aerosol che facilitano la diffusione della contaminazione.
nota: L'idrogeno solforato è un sottoprodotto metabolico naturale di molti batteri anaerobi e il suo accumulo è tossico per i batteri e può causare danni all'elettronica e ridurre la durata di un catalizzatore.
- Utilizzare una scatola a ventaglio per far circolare l'atmosfera della camera attraverso un catalizzatore al palladio, che rimuove l'ossigeno in presenza di idrogeno (Figura 1D).
Nota: un filtro atmosferico a ricircolo (HEPA (particolato d'aria ad alta efficienza) rimuove i contaminanti presenti nell'aria con una dimensione di 0,22 μm o superiore.
- Coltura di batteri anaerobi in un incubatore a 37 °C che si trova all'interno della camera anaerobica. Utilizzare tecniche asettiche standard quando si lavora all'interno della camera anaerobica.
2. Preparazione di batteri anaerobi
Nota: P. gingivalis è aerotollerante e può essere conservato in condizioni aerobiche, ma non crescerà in presenza di ossigeno a livelli superiori al 6%. Una camera anaerobica è necessaria per la corretta coltivazione di P. gingivalis e di altre specie anaerobiche (Figura 1). Prima di lavorare con i micro anaerobi, è necessaria un'adeguata formazione e istruzione sull'uso della camera anaerobica.
- Equilibrare tutti i mezzi liquidi e le piastre in condizioni anaerobiche per almeno 12 ore prima della sperimentazione per rimuovere l'ossigeno residuo.
- Trasferire P. gingivalis da un congelatore a -80 °C a una camera anaerobica e lasciare scongelare.
- Striatura di P. gingivalis su piastre di agar di sangue di soia tripticasi (TSA II con il 5% di sangue di pecora). Avvolgere le piastre in parafilm e conservarle a 37 °C in un incubatore anaerobico per 4-7 giorni.
- Inoculare P. gingivalis in 3 ml di brodo per infusione di cuore cerebrale (BHI) integrato con emina e menadione, un terreno liquido arricchito non selettivo per l'isolamento e la coltura di microrganismi anaerobi e fastidiosi, utilizzando anse sterili.
nota: Per la conservazione a lungo termine, mescolare le colture batteriche preparate in BHI con glicerolo o DMSO (concentrazione finale del 10-20%) e porre in congelatore a -80 °C.
- Preparare una coltura iniziale di P. gingivalis effettuando una diluizione 1:10 e lasciando crescere i batteri fino alla fase di metà logaritmica.
Nota: Viene determinata la densità ottica della sospensione batterica e viene regolata la concentrazione batterica per ogni ceppo da esaminare. Per P. gingivalis una sospensione a OD660 di 0,7 corrisponde alla fase logaritmica intermedia e ~7 x 108 cellule/ml. Le condizioni di crescita descritte nel protocollo di cui sopra sono specifiche per P. gingivalis e potrebbero dover essere adattate per altri ceppi batterici.
3. Coltura cellulare endoteliale
Nota: Acquistare HUVEC primari aggregati e coltura in terreno basale contenente fattori di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) a 37 °C in CO2 al 5% secondo le istruzioni del produttore.
- Seme di HUVEC in fiasche T-75 a 2,5 x 105 cellule/pallone in 15 ml di terreno VEGF.
nota: Verificare la vitalità mediante una diluizione 1:1 con il 4,0% di blu di tripano. Le cellule con una membrana compromessa manterranno il blu di tripano e le cellule sane con membrane intatte appariranno bianche se osservate al microscopio ottico binoculare. Conta 100 celle e assicurati che oltre l'80% delle cellule sia vitale.
- Sostituire il terreno ogni 2 giorni con un terreno in VEGF fresco preriscaldato fino a quando le celle non raggiungono una confluenza del ~80%.
- Lavare le celle una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata. Liberare le cellule dal pallone T75 incubando con 2 ml di tripsina-EDTA (0,25%) per 5 minuti seguiti da 2 ml di soluzione neutralizzante della tripsina.
- Raccogliere gli HUVEC sospesi in una provetta conica da 50 ml. Lavare le cellule in eccesso dai flaconi di T-75 con PBS e trasferirle in provette coniche da 50 ml.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 10 min.
- Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di VEGF preriscaldato.
- Determinare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o un dispositivo di conteggio cellulare simile.
- Calcolare la quantità di sospensione cellulare da aggiungere a una piastra a 6 pozzetti (400.000/pozzetto) o a una piastra a 12 pozzetti con vetrini coprioggetti (50.000/pozzetto). Gli HUVEC saranno pronti per la sperimentazione il giorno successivo.
4. Saggio di sopravvivenza Invasione/Interazione (placcatura)
Nota: Quando si esegue questo test, preparare due piastre a 6 pozzetti di cellule endoteliali seminate a 400.000 cellule/pozzetto. Una piastra sarà utilizzata per valutare i batteri attaccati e internalizzati dalle cellule ospiti. L'altra placca terrà conto dei batteri intracellulari. La piastra a 6 pozzetti consente di eseguire triplicati di due campioni in un esperimento. Per una descrizione di questo protocollo, fare riferimento al diagramma di flusso del test di sopravvivenza (Figura 2).
- Preparare i batteri anaerobi come descritto sopra (vedere paragrafo 1) fino a raggiungere la crescita a metà log (OD660 0,5-0,7).
- Centrifugare i batteri a 5.000 x g per 10 min.
Nota: se la centrifuga si trova all'esterno di una camera anaerobica, trasportare i campioni batterici in una provetta da 15 ml ermeticamente sigillata e avvolgere il tappo con parafilm per evitare perdite di ossigeno.
- Riposizionare il P. gingivalis pellettato nella camera e scartare il surnatante. Lavare nuovamente con PBS e batteri in pellet prima di risospendere in VEGF. Preparare le sospensioni per tutti i ceppi batterici da testare a OD660 di 0,7, che corrisponde alla fase di log medio (~7 x 108 cellule/ml). I batteri sono ora pronti per l'infezione.
- Trasferire piastre a 6 pozzetti contenenti HUVEC dall'incubatore per colture tissutali alla camera anaerobica. Rimuovere il terreno e lavare tre volte con PBS anaerobico. Aggiungere 2 ml di terreno anaerobico VEGF a ciascun pozzetto e posizionare le piastre a 37 °C nell'incubatore anaerobico per 20 minuti per bilanciare la temperatura per l'infezione.
nota: Placcare i batteri sulle piastre di agar sanguigno per garantire che quelli utilizzati per l'infezione siano omogenei e non contaminati in caso di infezione.
- Infettare le cellule ospiti con batteri ad una molteplicità di infezioni (batteri MOI: ospite) di 100:1.
nota: Il numero di cellule HUVEC viene determinato eseguendo un test di esclusione del tripano su un singolo pozzetto prima dell'infezione. Il numero di cellule batteriche viene determinato tramite la densità ottica (ad esempio, OD di 0,5 = 5 x 108 cellule/ml). La concentrazione batterica viene regolata al corretto MOI in base alla concentrazione di HUVEC.
- Posizionare le piastre a 6 pozzetti con HUVEC infetti nell'incubatore anaerobico e lasciare che i batteri interagiscano con le cellule ospiti per 30 minuti.
- Preparare la saponina in BHI (1,0% p/v) all'interno della camera anaerobica e filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm.
- Sopravvivenza sia dei batteri attaccati che di quelli internalizzati.
- Estrarre le piastre dall'incubatore, aspirare il terreno, lavare tre volte con PBS anaerobico e aggiungere 2 ml di saponina filtrata all'1,0% (preparata come descritto al punto 4.8). Incubare per 15 minuti per consentire la lisi delle cellule ospiti.
- Raschiare il fondo di ogni pozzetto con un raschietto per cellule. Raccogliere la miscela di celle da ogni pozzetto ed effettuare una diluizione 1:1 in BHI.
- Procedere con le diluizioni seriali del campione. A seconda della specie batterica e della concentrazione, regolare le diluizioni seriali. Iniziare con diluizioni 1:100 o 1:1.000.
- Piastra 200 μl della diluizione desiderata su piastre di agar sanguigno. Avvolgere le piastre in parafilm e posizionarle nell'incubatore anaerobico a 37 °C.
- Dopo sette giorni di incubazione a 37 °C, rimuovere le piastre e contare le unità formanti colonie (CFU) utilizzando una lightbox per contare manualmente le colonie.
nota: I CFU sono enumerati. Per un numero maggiore di CFU, è possibile scattare immagini e utilizzare software informatici per facilitare l'enumerazione dei CFU.
