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1. Internalizzazione di batteri in cellule ospiti (microscopia fluorescente)
Nota: P. gingivalis è marcato con 2',7'-Bis-(2-Carbossietil)-5-(e-6)-Carbossifluoresceina, Acetossimetil estere (BCECF-AM). BCECF-AM è un colorante non fluorescente permeabile alla membrana; la sua conversione in fluoresceina BCECF attraverso l'azione delle esterasi intracellulari può indicare la vitalità cellulare. P. gingivalis viene marcato con il colorante BCECF-AM e quindi utilizzato per infettare le cellule eucariotiche. Dopo l'infezione, le cellule vengono fissate e marcate con DAPI e TRITC-falloidina. La colorazione DAPI utilizzata per colorare il nucleo della cellula eucariotica etichetterà anche il nucleo della cellula batterica, fornendo una contromisura per identificare i batteri non vitali che non possono scindere metabolicamente BCECF-AM. Le cellule ospiti sono evidenziate con TRITC-falloidina, un colorante rosso di actina.
- Vetrini coprioggetti per autoclave. Aggiungere asetticamente i vetrini coprioggetti alle piastre a 12 pozzetti prima di seminare le cellule endoteliali a 5 x 104 cellule/pozzetto. (Preparato il giorno prima dell'esperimento)
- Preparare le cellule endoteliali su vetrini coprioggetti circolari da 18 mm (spessore #1,5) in piastre a 12 pozzetti come descritto sopra.
- Preparare batteri anaerobi cresciuti fino alla fase di metà log (OD660 = 0,5-0,7).
- Lavare i batteri 2 volte con PBS anaerobico centrifugando a 5.000 x g e sospendendo il pellet in PBS a 5-7 x 108 cellule/ml.
- Aggiungere 20 μl di 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml di sospensione batterica (5-7 x 108 cellule/ml) a una concentrazione finale di BCECF-AM di 2 μM.
- Incubare a 37 °C per 30 minuti al buio.
- Trasferimento di piastre con cellule endoteliali seminate su vetrini circolari da 18 mm (spessore #1,5) dall'incubatore per colture tissutali alla camera anaerobica. Lavare con PBS e sostituire con VEGF anaerobico media.
Nota: verificare che gli HUVEC siano sani al microscopio ottico. Gli HUVECS dovrebbero essere confluenti ~80%, la morfologia dovrebbe essere paragonabile a quella dei produttori.
- Centrifugare i batteri marcati a 5.000 x g per 10 minuti per rimuovere il colorante BCECF-AM residuo. Sospendere in 2 ml di terreno anaerobico in VEGF.
- Infettare le cellule ospiti con batteri marcati a MOI di 100:1 (batteri: ospite).
- Incubare in camera anaerobica a 37 °C per 30 min.
- Dopo l'infezione, lavare le cellule con PBS tre volte e fissarle in paraformaldeide al 4,0% appena preparata per 10 min.
nota: Dopo aver fissato le cellule, gli esperimenti possono essere condotti al di fuori della camera anaerobica.
- Lavare i vetrini coprioggetti con PBS tre volte.
- Aggiungere 1 ml di Triton X-100 allo 0,2% per 10 min.
- Lavare i vetrini coprioggetti con PBS tre volte.
- Aggiungere 50 μl di falloidina TRITC (50 μg/ml) ai vetrini coprioggetti per 45 minuti.
- Lavare i vetrini coprioggetti tre volte, rimuoverli dalla piastra a 12 pozzetti e posizionarli su un vetrino con un supporto di montaggio soft-set contenente DAPI. Sigillare i lati con smalto per unghie.
nota: I vetrini possono essere conservati per un paio di mesi al buio. Evitare l'esposizione alla luce per evitare il fotosbiancamento.
- Visualizzazione dei vetrini con un microscopio confocale.
- In questo caso, è possibile utilizzare un sistema spettrale a 34 canali (rivelatore array a 32 canali e due rivelatori PMT laterali, più un rivelatore a luce trasmessa) configurato attorno a un supporto AxioObserver (invertito) con uno stadio XY motorizzato. Il sistema dispone di cinque laser: diodo blu (405 nm), Argon multilinea (458, 488, 514 nm), diodo verde (561 nm), HeNe rosso (633 nm) e un laser pulsato da 440 nm. Equipaggia un sistema di imaging a fluorescenza con 2 rivelatori GaAsP ibridi (per FRET-FLIM).
- Rileva la fluorescenza da DAPI e TRITC in un canale utilizzando un filtro a doppia banda con lunghezze d'onda di eccitazione di 340-380 nm e 540-560 nm e un filtro di emissione rispettivamente di 435-485 nm e 570-590 nm. Rilevare la fluorescenza da BCECF-AM utilizzando un filtro con lunghezza d'onda di eccitazione di 440-500 nm e un filtro di emissione di 510-590 nm.
nota: I controlli per BCECF-AM devono essere effettuati su ogni ceppo batterico studiato per garantire una corretta etichettatura dei batteri vitali. Innanzitutto, convalidare che i batteri non vitali siano DAPI-positivi e BCECF-negativi. In secondo luogo, assicurarsi che i batteri vivi possano metabolizzare BCECF-AM in fluoresceina BCECF. Potrebbe essere necessario testare concentrazioni variabili dei batteri o del colorante BCECF-AM per un'etichettatura ottimale.