1. Coltura, differenziazione e convalida delle cellule HL-60
- Preparare un terreno di coltura cellulare HL-60 composto da 500 mL di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con L-glutammina e 50 mL di siero fetale bovino inattivato termicamente. Non aggiungere antibiotici in quanto ciò potrebbe influenzare la differenziazione delle cellule HL-60.
- Per la propagazione/mantenimento delle cellule HL-60, coltivare 5 x 106 cellule in 10 mL di terreno di coltura cellulare HL-60 in 2 palloni ventilati da 75 cm a37 °C e 5% di anidride carbonica (CO2). Passaggio delle cellule ogni 3-4 giorni per mantenere concentrazioni cellulari ottimali.
nota: La concentrazione cellulare non deve superare 5 x 106/mL.
- Generare scorte di lavoro di cellule HL-60 aliquotando circa 1 x 106 cellule/mL in terreni di coltura HL60 con dimetilsolfossido (DMSO) al 10% in provette criogeniche da 1 mL.
nota: Le scorte di lavoro possono essere conservate a -80 °C. Il master deve essere conservato a -120 °C.
- Differenziare le cellule HL-60 coltivando 1,5 x 107 cellule in 15 mL di terreno di coltura cellulare HL-60 con 0,6% di N, N-dimetilformammide (DMF) a 37 °C e 5% di CO2 in flaconi sterili da 75 cm2 con filtro per 3 giorni prima dell'attività di uccisione opsonofagocitaria (OPKA).
- Verificare che le cellule HL-60 siano state differenziate con successo e siano appropriate per l'uso nel test OPKA testando la vitalità e i marcatori della superficie cellulare secondo i protocolli di citometria a flusso stabiliti. Dopo la differenziazione, raccogliere le cellule HL-60 e colorare circa 1 x 104 cellule con anticorpi/coloranti coniugati fluorescenti per CD71, CD35, annessina V e ioduro di propidio.
nota: Le cellule differenziate devono essere vitali per il ≥65%, per il ≥55% CD35+ e per il ≤20% CD71+, come determinato attraverso protocolli di convalida stabiliti (Figura 1).
2. Preparazione di tamponi e reagenti OPKA
- Preparare 50 mL di tampone di opsonizzazione sterile B (OBB) mescolando 42,5 mL di soluzione fisiologica sterile 1x tamponata con fosfato (PBS) con Ca2+/Mg2+, 5 mL di siero fetale bovino inattivato termicamente e 2,5 mL di gelatina sterile allo 0,1%. Conservare a 4 °C.
- Procurarsi il complemento per coniglietti e conservare a -80 °C.
- Ottenere o preparare piastre di coltura batterica (ad esempio, piastre di agar di sangue di pecora15 x 100 mm 2 al 5%).
3. Preparazione dei campioni di stock batterici
- Procurarsi una scorta del/i ceppo/i batterico/i da testare.
NOTA: Per questo protocollo, viene utilizzato il sierotipo 3 Streptococcus pneumoniae (WU2, generosamente fornito dal Dr. Moon Nahm).
- Far crescere il ceppo batterico in un brodo appropriato (ad esempio, brodo di Todd-Hewitt + 0,5% di estratto di lievito per questo ceppo WU2) per circa 2-4 ore a 37 °C.
nota: La densità ottica a 600 nm (OD600) della coltura dovrebbe essere compresa tra 0,6 e 0,8.
- Pellettare i batteri mediante centrifugazione a 6.000 x g per 2 minuti e risospendere le cellule in 10-30 mL di glicerolo al 15% nel brodo appropriato. Aliquotare la coltura batterica (500 μl per aliquota) in provette da centrifuga sterili da 1,5 mL e conservare a -80 °C.
- Scongelare una fiala di brodo batterico a bagnomaria a 37 °C. Pellettare le cellule batteriche e risospendere in 500 μL di OBB in condizioni sterili.
- Preparare diverse diluizioni del ceppo batterico in OBB (es. 10 μL di nessuna diluizione, 10 μL di 1:10, 10 μL di 1:100, ecc.). Eseguire il test OPKA (sezioni 4-6, inclusa la co-coltura HL-60/complemento) come descritto di seguito utilizzando varie diluizioni del ceppo batterico non trattato. Coltivare le piastre per una notte a 30 °C (senza CO2).
nota: La temperatura di 30 °C è specifica per WU2 per prevenire la crescita eccessiva; altri ceppi/sierotipi possono crescere in modo ottimale a 37 °C.
- Contare le colonie per ogni diluizione di stock batterico non trattato co-coltivato con cellule HL-60 e complemento. Determinare quale diluizione dei batteri produce il numero ottimale di colonie numerabili (circa 80-120 unità formanti colonie (CFU) per i batteri non trattati co-coltivati con cellule HL-60). Si noti questa diluizione per i futuri OPKA che coinvolgono questo stock batterico.
4. Trattamento e coltura batterica
- Scongelare un tubo di brodo batterico preparato al punto 3.3. Pellettare i batteri (6.000 x g per 2 min) e risospendere il pellet cellulare in OBB alla diluizione ottimale come determinato al punto 3.6.
- Pipettare 10 μl di diluizione batterica risospesa per pozzetto in una piastra per coltura cellulare a fondo tondo da 96 pozzetti.
- Aggiungere 20 μL di anticorpi appropriati o di trattamento farmacologico a ciascun pozzetto sperimentale in duplicato.
NOTA: In questo protocollo, un anticorpo sierotipo-specifico generato nei topi viene aggiunto come trattamento X e un enzima glicoside idrolasi noto per degradare la capsula polisaccaridica del sierotipo 3 viene aggiunto come trattamento Y (Figura 2). Per i pozzetti di controllo, utilizzare 1x PBS o OBB, a seconda del tampone utilizzato per i pozzetti di trattamento.
- Agitare la piastra del campione a circa 90 giri/min per 1 ora a temperatura ambiente. Regolare queste condizioni in base alla temperatura ottimale o alle condizioni di agitazione dei trattamenti in fase di test.
5. Co-coltura batterica HL-60
- Preparare le cellule HL-60 raccogliendo le cellule differenziate HL-60 trattate con DMF tre giorni prima (vedere passaggio 1.4) in provette coniche da 15 mL. Pellettare le cellule (500 x g, 3 min), scartare il surnatante e lavare con almeno 10 mL di 1x PBS.
- Pellettare le cellule lavate (500 x g, 3 min), scartare il surnatante e risospendere le cellule in OBB (iniziare con 1 mL di OBB e regolare per ottenere una concentrazione finale di 1 x 107/mL dopo il conteggio delle cellule).
- Aggiungere il complemento di coniglietto (siero di coniglio sterile, non diluito, età 3-4 settimane) a un volume finale 1:5.
nota: La concentrazione finale della miscela HL-60-complemento deve essere 1 x 107/mL. Se si verifica la dipendenza dal complemento, si può utilizzare una seconda soluzione contenente cellule HL-60 attive con complemento inattivato dal calore (il complemento può essere inattivato incubando in bagnomaria a >55 °C per almeno 30 minuti).
- Dopo aver completato 1 ora di coltura batterica (passaggio 4.4), dividere ogni campione (cioè 10 μL di ogni pozzetto da 30 μL in due nuovi pozzetti) in pozzetti duplicati per due gruppi (cioè, utilizzare solo 20 μL della co-coltura originale da 30 μL per tenere conto dell'errore di pipettaggio): un set sarà co-coltivato con il complemento HL-60 e uno includerà solo i batteri. Aggiungere 50 μl della miscela HL-60-complemento (dal passaggio 5.3) a ciascun set sperimentale di pozzetti (delegato +HL-60); aggiungere 50 μL di OBB da solo ai pozzetti dei soli batteri (delegato -HL-60).
nota: Per questo esempio, circa 800 CFU batteriche sono state utilizzate per la co-coltura iniziale con 5 x 10cellule HL-60 da 5/50 μL. Se questa molteplicità di infezioni è troppo alta o troppo bassa, come indicato dal numero finale di colonie, regolare la diluizione batterica iniziale rispetto alla conta delle cellule HL-60.
- Agitare la piastra a 96 pozzetti a 37 °C per 1 ora (senza CO2).
6. Placcatura del campione e incubazione notturna
- Diluire ogni pozzetto 1:5 con OBB, in modo che ogni campione abbia un volume di almeno 50 μl.
- Pipettare 50 μl di ciascun campione direttamente su un'area designata di una piastra di coltura batterica, garantendo un'adeguata spaziatura tra i campioni. Perpiastre di agar rotonde da 15 x 100 mm, pipettare circa 4 campioni su una piastra.
- Coprire e lasciare asciugare i campioni per circa 15 minuti a temperatura ambiente.
- Capovolgere le piastre e fermentare per una notte a 30 °C (senza CO2). In alternativa, piastre di coltura in barattoli anaerobici per verificare se le condizioni anossiche influenzano la crescita batterica o per controllare la morfologia.
- Dopo la coltura notturna, contare le colonie in ciascuna area di campionamento designata. Analizzare i dati confrontando il numero di cellule vive in ciascun set con il controllo corrispondente e/o i campioni che non ricevono la co-coltura cellulare HL-60 (indicativa di sopravvivenza cellulare al 100%, uccisione cellulare dello 0%).
