Valutazione del porphyromonas gingivalis internalizzato nelle cellule endoteliali dell'ospite

Abstract

Fonte: Wunsch, C. M., et al. Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la valutazione dell'interazione dei batteri anaerobi con le cellule ospiti. (2015)

In questo video, dimostriamo un test per valutare la sopravvivenza di Porphyromonas gingivalis all'interno delle cellule endoteliali umane. La misura della sopravvivenza e della crescita di Porphyromonas gingivalis internalizzato è valutata dal numero di colonie sulla piastra di agar sanguigno.

Protocollo

1. Sopravvivenza dei batteri internalizzati.

1. Preparare i batteri anaerobi di P. gingivalis fino a quando non raggiungono la metà della crescita logaritmica (OD₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Centrifugare i batteri a 5.000 x g per 10 min.
3. Riposizionare il P. gingivalis pellettato nella camera e scartare il surnatante. Lavare nuovamente con PBS e batteri in pellet prima di risospendere in VEGF. Preparare le sospensioni per tutti i ceppi batterici da testare a OD₆₆₀ di 0,7, che corrisponde alla fase di log medio (~7 x 10⁸ cellule/ml). I batteri sono ora pronti per l'infezione.
4. Trasferire piastre a 6 pozzetti contenenti HUVEC dall'incubatore per colture tissutali alla camera anaerobica. Rimuovere il terreno e lavare tre volte con PBS anaerobico. Aggiungere 2 ml di terreno anaerobico in VEGF a ciascun pozzetto e posizionare le piastre a 37 °C nell'incubatore anaerobico per 20 minuti per bilanciare la temperatura per l'infezione.
5. Infettare le cellule ospiti con batteri ad una molteplicità di infezioni (batteri MOI: ospite) di 100:1.
   nota: Il numero di cellule HUVEC viene determinato eseguendo un test di esclusione del tripano su un singolo pozzetto prima dell'infezione. Il numero di cellule batteriche viene determinato tramite la densità ottica (ad esempio, OD di 0,5 = 5 x 10⁸ cellule/ml). La concentrazione batterica viene regolata al corretto MOI in base alla concentrazione di HUVEC.
6. Posizionare piastre a 6 pozzetti con HUVEC infetti in un incubatore anaerobico e lasciare che i batteri interagiscano con le cellule ospiti per 30 minuti.
7. Preparare la saponina in BHI (1,0% p/v) all'interno della camera anaerobica e filtrare attraverso un filtro da 0,2 μm.
8. Rimuovere le piastre dall'incubatrice. Lavare tre volte con PBS anaerobico e aggiungere 2 ml di terreno VEGF con antibiotico integrato (300 μg/ml di gentamicina e 400 μg/ml di metronidazolo).
9. Incubare per 1 ora. Assicurati di testare gli antibiotici in modo che siano efficaci al 100% nell'uccidere il ceppo batterico desiderato e assicurati che non penetrino nelle cellule ospiti.
10. Aspirare il terreno, aggiungere 2 ml di saponina filtrata all'1,0%. Incubare per 15 minuti per consentire la lisi delle cellule ospiti.
11. Raschiare il fondo di ogni pozzetto con un raschietto per cellule. Raccogliere la miscela di celle da ogni pozzetto ed effettuare una diluizione 1:1 in BHI.
12. Preparare diluizioni seriali del campione (1:100, 1:1.000).
13. Piastra 200 μl della diluizione desiderata su piastre di agar sanguigno. Avvolgere le piastre in parafilm e posizionarle in un'incubatrice anaerobica.
14. Dopo sette giorni di incubazione a 37 °C, rimuovere le piastre e contare le CFU.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Camera anaerobica vinilica-Tipo B	Prodotti da laboratorio Coy		Incubatrice modello 2000
TSA II Tripticasi Agar di Soia con 5% di sangue di pecora	Bbl	221261
Pool di cellule endoteliali della vena ombelicale umana a 10 donatori	Tecnologia LifeLine	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Kit Completo	Tecnologia LifeLine	LL-0003
TrypKit	sagola di salvataggio	LL-0013
saponina	Riedel-de Haen	Codice: 16109
Sale di Gentamicina Solfato	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761