Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Espressione e purificazione degli anticorpi
- Mantenimento delle cellule ovariche di criceto cinese (CHO)
- Coltivare cellule CHO in terreni CHO FreeStyle integrati con 1x integratore di glutammina disponibile in commercio a 37 °C, agitando a 130 giri/min con il 5% di CO2 utilizzando fiasche di Erlenmeyer delong, in vetro o monouso.
nota: Si consiglia vivamente di utilizzare un pallone deflettore con un tappo ventilato per aumentare l'agitazione e migliorare il trasferimento di gas durante le condizioni di agitazione. La resa anticorpale è stata significativamente ridotta con fiasche normali (non deflettore) a causa della limitata agitazione della coltura in sospensione.
- Mantenere il numero di cellule tra 1-5 x 106 cellule/mL con una vitalità cellulare del >95%. Se il numero di cellule aumenta oltre 5 x 106 cellule/mL, dividere le cellule. Non lasciare mai che le cellule CHO raggiungano meno di 0,2 x 106 cellule/mL.
- Trasfezione di cellule CHO
- Coltivare cellule CHO in 200 mL di terreno (2 x 106 cellule/mL) in palloni deflettori Erlenmeyer delong.
nota: Le colture in sospensione coltivate in fiasche defunte hanno sempre prodotto rese proteiche più elevate rispetto a quando coltivate in fiasche non deflettori.
- In una provetta da 15 mL, prelevare 5 mL di terreno CHO FreeStyle e aggiungere 50 μg di DNA clone VH e 75 μg di DNA clone VL. Vortice per mescolare bene.
- Incubare la miscela di DNA a temperatura ambiente per 5 min.
nota: Un'incubazione più lunga riduce la resa proteica.
- Aggiungere 750 μL di 1 mg/mL di polietilenimmina (PEI) alla soluzione di DNA e agitare aggressivamente la miscela per 30 s. Incubare a temperatura ambiente per altri 5 min.
nota: Il PEI deve essere prodotto fresco. Più cicli di gelo-scongelamento di PEI riducono significativamente la resa complessiva.
- Aggiungere l'intera miscela di DNA e PEI alle cellule agitando manualmente il pallone. Incubare immediatamente i palloni deflettori di Erlenmeyer delong con celle a 37 °C che agitano a 130 giri/min.
- Espressione
nota: L'anticorpo ha un peptide segnale secretorio ingegnerizzato alla sua estremità N-terminale, che aiuta gli anticorpi a essere secreti nel mezzo.
- Far crescere le cellule trasfettate a 37 °C, agitando a 130 giri/min il giorno 1.
- Il giorno 2, aggiungere 2 ml di agente antiaggregante 100x e 2 ml di soluzione antibatterico-antimicotica 100x. Spostare il pallone a una temperatura più bassa (32-34 °C), agitando a 130 giri/min.
- Ogni cinque giorni, aggiungere 10 ml di mangime Tryptone N1 e 2 ml di integratore di glutammina 100x.
- Continuare a contare le cellule ogni tre giorni utilizzando un emocitometro dopo aver colorato un'aliquota di cellule con una colorazione blu di tripano. Assicurarsi che la vitalità cellulare rimanga al di sopra dell'80%.
- Il giorno 10 o 11, raccogli il terreno per la purificazione degli anticorpi. Centrifugare la coltura a 3000 x g, 4 °C per 40-60 minuti e quindi filtrare il terreno trasparente utilizzando filtri per bottiglie da 0,22 μM.
- Purificazione
nota: La purificazione degli anticorpi viene eseguita utilizzando una colonna di proteina-A disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali), utilizzando una pompa peristaltica.
- Equilibrare la colonna con il volume a due colonne del tampone legante (20 mM di fosfato di sodio a pH 7,4).
- Far passare il terreno filtrato contenente l'anticorpo (ottenuto al punto 1.3.5) attraverso la colonna alla velocità di flusso di 1 mL/min.
- Lavare la colonna con il volume a due colonne del tampone di legatura.
- Eluire l'anticorpo in frazioni di 500 μl utilizzando 5 mL di tampone di eluizione (30 mM di acetato di sodio a pH 3,4).
- Neutralizzare il pH dell'anticorpo eluito aggiungendo 10 μl di tampone di neutralizzazione (3 M di acetato di sodio a pH 9) per frazione.
nota: La frazione di numero 3-6 contiene la maggior parte dell'anticorpo. Si consiglia di conservare tutte le frazioni nel caso in cui l'anticorpo venga eluito in una frazione successiva a quella prevista.
- Misurare la concentrazione di anticorpi purificati utilizzando uno spettrofotometro selezionando il protocollo predefinito per l'immunoglobulina G (IgG). La concentrazione finale dell'anticorpo si ottiene in mg/mL considerando il peso molecolare e il coefficiente di assorbimento.
2. Etichettatura fluorescente
NOTA: Gli anticorpi sono marcati con il colorante a infrarossi che contiene un gruppo reattivo estere NHS, che si accoppia alle proteine e forma un coniugato stabile. Questa reazione è sensibile al pH e funziona meglio a pH 8,5. I coniugati fluorescenti marcati con il colorante mostrano un assorbimento massimo di 774 nm e un'emissione massima di 789 nm. Il pH 8,5 è la chiave per una coniugazione efficace.
- Dializzare 0,5 mL di anticorpo utilizzando una cassetta per dialisi (0,1-0,5 mL) in 1 L di tampone di coniugazione (50 mM di tampone fosfato a pH 8,5). Dopo 4 ore, trasferire la cassetta per dialisi in un tampone fresco e dializzare durante la notte.
- Impostare una reazione di coniugazione aggiungendo 0,03 mg di IRDye 800CW per 1 mg di anticorpo in un volume di reazione di 500 μL.
nota: IRDye 800CW è disciolto in DMSO ad una concentrazione di 10 mg/mL.
- Eseguire le reazioni di marcatura per 2 ore a 20 °C.
nota: Aumentare il tempo oltre le 2 ore non migliora l'etichettatura.
- Purificare i coniugati marcati mediante dialisi estesa contro 1x PBS.
- Stimare il grado di marcatura misurando l'assorbanza del colorante a 780 nm e l'assorbanza della proteina a 280 nm. Il contributo del colorante al segnale a 280 nm è del 3%.
- Calcola il rapporto colorante/proteine usando questa formula:
dove 0,03 è un fattore di correzione per l'assorbanza del colorante utilizzato a 280 nm (pari al 3,0% della sua assorbanza a 780 nm), εDye e εProtein sono coefficienti di estinzione molare rispettivamente per il colorante e la proteina (anticorpo).
NOTA: εIl colorante è 270.000 M-1 cm-1 e εLa proteina è 203.000 M-1 cm-1 (per una tipica IgG) in una miscela 1:1 di PBS: metanolo. Le proteine diverse dalle IgG possono avere coefficienti di estinzione molare molto diversi. L'uso del corretto coefficiente di estinzione per la proteina di interesse è essenziale per la determinazione accurata del rapporto D/P.
- Calcola la concentrazione proteica finale utilizzando questa formula:
nota: Confermare sempre l'efficacia di legare l'antigene degli anticorpi marcati e non marcati utilizzando ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) o citometria a flusso prima di procedere con gli studi in vivo.
3. Studi sugli xenotrapianti nei topi
- Preparazione di cellule tumorali per l'iniezione
- Coltiva le cellule OVCAR-3 in RPMI-1640 Medium, integrato con il 10% di FBS e 1x penicillina-streptomicina.
- Il giorno prima dell'iniezione, sottocoltivare le cellule in nuove piastre di coltura da 100 mm con 10 mL di terreno/piastra completa. Utilizzare un numero di celle di 0,5-1 x 106 celle/piatto.
- Incubare le colture a una temperatura di 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2 per 20-24 ore.
- Il giorno dell'iniezione, rimuovere il terreno di coltura dalle piastre di coltura. Sciacquare accuratamente lo strato cellulare con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco libera di Ca2+/Mg2+ (DPBS) per rimuovere le cellule morte, i detriti cellulari e tutte le tracce di siero, che possono interferire con l'azione della tripsina.
- Tripsinizzare le cellule aggiungendo 1,0-1,5 mL di soluzione di tripsina-EDTA a ciascuna piastra e provare a diffondere la soluzione inclinando la capsula tutt'intorno, seguita da incubazione a 37 °C per 5-10 min.
nota: Osservare le cellule al microscopio invertito per verificare lo stato effettivo della tripsinizzazione. La tripsinizzazione in difetto si traduce in un minor numero di cellule che si staccano dalla superficie della piastra di coltura, mentre la tripsinizzazione eccessiva induce stress cellulare. Quindi, una corretta tripsinizzazione è importante.
- Aggiungere 1,0-1,5 mL di terreno di coltura completo a ciascun piatto per arrestare l'azione della tripsina, dopodiché risospendere le cellule pipettando delicatamente.
nota: Il pipettaggio delicato è importante per mantenere la salute delle cellule.
- Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 250 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Raccogliere il pellet della cella dopo aver rimosso il surnatante e lavare le celle rimettendo in sospensione il pellet in 1x DPBS.
- Far girare la sospensione cellulare a una bassa velocità di 250 x g per 5 min.
- Aggiungere 500 μl di DPBS e risospendere le cellule mediante pipettaggio delicato per ottenere una sospensione a singola cellula.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
nota: Per una migliore precisione, ripetere il conteggio tre volte e fare una media.
- Regolare il volume in modo tale che la densità cellulare finale sia di 1 x 108 cellule/mL.
- Iniezione sottocutanea di cellule per sviluppare xenotrapianti di topo
nota: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di sicurezza BSL2. I topi Athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+ sono stati utilizzati nel presente studio.
- Prelevare 50 μL della sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL e miscelare con 50 μL di terreno della matrice della membrana basale.
nota: Il terreno della matrice della membrana basale tende a formare uno stato gelatinoso a temperatura ambiente, quindi mantenere attentamente le cellule e la miscela del mezzo della matrice sul ghiaccio. Si consiglia di conservare tubi, puntali e siringhe in frigorifero e poi trasferirli sul ghiaccio prima dell'iniezione animale.
- Agitare la miscela per evitare la formazione di grumi cellulari. Quindi, prelevare questi 100 μl della miscela di terreno di sospensione cellulare-matrice che contiene 5 x 106 cellule, in una siringa da 1 cc.
- Sollevare delicatamente la pelle dell'animale per separare la pelle dallo strato muscolare sottostante e iniettare lentamente la sospensione cellulare (100 μL) sotto la pelle (5 x 106 cellule), con un ago da 26 G. Attendere alcuni secondi prima di estrarre l'ago, in modo che il terreno della matrice basale possa formare la struttura semisolida simile a un gel insieme alle cellule sotto la pelle, impedendo la fuoriuscita della miscela dal sito di iniezione.
nota: Le cellule devono essere testate prima dell'iniezione per qualsiasi contaminazione che possa danneggiare i topi immunodeficienti. Durante l'iniezione, non inserire l'ago troppo in profondità nella pelle in quanto ciò potrebbe formare il tumore più in profondità del previsto.
- Tenere l'animale in una gabbia sterile e osservare per circa 20 minuti.
- Osserva i topi per 2-3 settimane e lascia che il tumore cresca fino a 500 mmdi dimensione 3.
4. Localizzazione di anticorpi utilizzando un sistema di imaging in vivo
NOTA: L'apparecchiatura di imaging in vivo (vedi Tabella dei materiali) utilizzata in questo esperimento utilizza un insieme di filtri ad alta efficienza e algoritmi di non miscelazione spettrale per la visualizzazione non invasiva e il monitoraggio dell'attività cellulare e genetica all'interno di un organismo vivente in tempo reale. Il sistema fornisce funzionalità di monitoraggio sia della fluorescenza che della bioluminescenza.
- Iniettare 25 μg di anticorpo marcato con colorante attraverso la vena caudale.
- Anestetizzare i topi portatori di tumore utilizzando isoflurano al 2%. Verificare la mancanza di risposta ai riflessi del pedale.
- Una volta che i topi smettono di muoversi, dilatare la vena laterale della coda applicando acqua di vermi.
- Iniettare 25 μg (in 100 μL) di anticorpo marcato utilizzando una siringa da insulina da 1 cc con un ago da 26 G.
- Allo stesso modo, come controllo negativo, etichettare e iniettare l'anticorpo non specifico dell'isotipo IgG1 che non ha come bersaglio le cellule tumorali.
- Eseguire l'imaging dal vivo in vivo dopo 8, 24, 48 ore, ecc. di iniezioni di anticorpi.
- Nel software associato, fare clic su Inizializza situato nel pannello di controllo e verificare che la temperatura del tavolino sia di 37 °C.
- Attivare l'alimentazione dell'ossigeno, tutte le pompe del sistema di anestesia e l'alimentazione del gas isoflurano alla camera dell'anestesia e impostare la valvola del vaporizzatore dell'isoflurano al 2%.
- Trasferisci i topi nella camera di anestesia e attendi che i topi siano completamente anestetizzati. Applicare l'unguento lubrificante per gli occhi per evitare la secchezza degli occhi.
- Vai al Pannello di controllo, imposta l'imaging a fluorescenza tramite l'opzione Imaging Wizard e seleziona l'eccitazione a 773 nm e l'emissione a 792 nm.
nota: Le impostazioni predefinite di esposizione automatica forniscono una buona immagine fluorescente. Tuttavia, le preferenze di esposizione automatica possono essere modificate in base alle esigenze.
- Trasferire i topi anestetizzati nella camera di imaging e assemblarli sul campo di imaging utilizzando un cono nasale. Lo stadio di imaging offre la possibilità di ospitare 5 topi alla volta.
nota: Avere i topi di controllo sottoposti a imaging insieme ai topi di prova per avere una quantità simile di esposizione e altre impostazioni durante l'analisi.
- Una volta che tutto è pronto, selezionare l'opzione Acquisisci sul pannello di controllo per l'acquisizione dell'immagine.
- Con le impostazioni di esposizione automatica, il sistema genera l'immagine in un minuto. L'immagine generata è la sovrapposizione della fluorescenza sull'immagine fotografica con l'intensità della fluorescenza ottica visualizzata in unità di conteggio o fotoni o termini di efficienza.
- Dopo aver acquisito l'immagine, trasferire i topi dalla camera di imaging alla loro gabbia e osservare il loro recupero per 1 o 2 minuti.
- Perfeziona ulteriormente l'immagine con gli strumenti e le funzioni forniti all'interno del software per l'analisi delle immagini. Gli strumenti di analisi delle immagini si trovano nella barra dei menu e nella tavolozza degli strumenti.
- In Regolazione immagine, regolare la luminosità, il contrasto o l'opacità e selezionare la scala di colori.
- Utilizza gli strumenti ROI per specificare una regione di interesse (ROI) in un'immagine ottica e misurare l'intensità del segnale all'interno della ROI. Se necessario, esportare i dati del segnale quantificato in un software per fogli di calcolo e tracciare i dati.
- Per gli studi di follow-up, analizzare le necroscopie dei topi di vari tessuti (ad es. fegato, polmone, cuore, rene, milza, cervello, ecc.) fianco a fianco per una distribuzione dettagliata non specifica di anticorpi marcati in fluorescenza.
nota: I dati possono essere ulteriormente supportati con l'ELISA tessuto-specifico utilizzando l'antigene (FOLR1 in questo caso) in 96 saggi a pozzetti.
