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1. Colorazione con citometria a flusso di cellule derivate da monociti infettate da Mtb
NOTA: I seguenti passaggi devono essere eseguiti in una struttura BSL-3. La colorazione con citometria a flusso può essere eseguita in una piastra a 96 pozzetti anziché in provette.
- Staccare il Mycobacterium tuberculosis, le cellule infettate da Mtb (e i controlli non infetti) dai pozzetti della piastra o delle piastre a 6 pozzetti mediante incubazione con 1 mL di tampone FACS per pozzetto per almeno 30 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Pipettare delicatamente su e giù alcune volte per assicurarsi che le cellule siano staccate. Se possibile, confermare il distacco delle cellule con la microscopia. Trasferire la sospensione cellulare da ciascun pozzetto in una provetta da microcentrifuga con tappo a vite e centrifugare le provette a 200 x g per 5 minuti. Eliminare con cura il surnatante pipettandolo.
- Lavare il pellet di cella in ogni provetta due volte con il tampone FACS e centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti.
- Colorare le cellule (da circa 0,5 x 106 a 1 x 106 cellule/provetta) con un cocktail di circa 50 μL di anticorpi anti-umani coniugati con fluorocromo tra cui TLR2 (AF647), CD206 (APC-Cy7), CD163 (BV605), CD80 (BV650), CCR7 (BV711), CD86 (BV786), CD200R (PE), CD64 (PE-Dazzle 594), HLA-DR (PE-Cy5) (Tabella 1) in combinazione con il colorante di vitalità Zombie-UV per 30 minuti a 4 °C (frigorifero) al buio.
- Lavare due volte le cellule colorate con 400 μL di tampone FACS e centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti.
- Fissare le cellule colorate con 200 μL di tampone di fissazione (appena preparato) per 30 minuti a RT al buio per garantire la completa inattivazione dei micobatteri.
- Lavare le cellule due volte con 400 μL di tampone FACS e centrifugare a 200 x g per 5 minuti per rimuovere il tampone di fissaggio in eccesso.
- Risospendere le cellule fissate in 400 μL di tampone FACS e trasferire i campioni in nuove provette da microcentrifuga da 1 mL prima di estrarle dal laboratorio BSL-3 per la citometria a flusso in BSL-2. Conservare le cellule colorate a +4 °C fino all'acquisizione del campione.
nota: Spruzzare le provette con etanolo al 70% prima di estrarle dal laboratorio BSL-3. La formaldeide è tossica (cancerogena) e deve essere maneggiata in una cappa di biosicurezza di classe II. Gettare i rifiuti di formaldeide in un rifiuto chimico separato.
2. Acquisizione di dati citometrici a flusso e analisi di cellule derivate da monociti infettate da Mtb
NOTA: I passaggi 2.1–2.2 devono essere eseguiti prima della colorazione con citometria a flusso descritta sopra. Per evitare problemi di aggregazione cellulare e dissociazione dei coloranti tandem dopo la fissazione cellulare, l'acquisizione del campione di cellule infettate da Mtb e non infette viene eseguita entro 4-10 ore dalla colorazione degli anticorpi primari.
- Prima della colorazione con citometria a flusso sopra descritta, compensare il segnale fluorescente per ciascun anticorpo coniugato con fluorocromo elencato nel pannello di colorazione (Tabella 1) utilizzando perle di compensazione (sia positive che negative).
- Titolare: la diluizione dell'anticorpo per la colorazione dei macrofagi umani per ottenere il segnale ottimale per ciascun fluorocromo.
- Utilizzare cellule non colorate per determinare il livello di fluorescenza di fondo necessario per impostare un gate per la popolazione cellulare negativa che consenta la visualizzazione delle cellule colorate (i macrofagi sono altamente autofluorescenti).
- Acquisire un minimo di 50.000 cellule/campione nel citometro a flusso utilizzando il software consigliato per l'acquisizione dei dati.
- Esportare i file di acquisizione dal citometro a flusso in formato FCS (Fluorimetria standard) 3.1.
- Analizza i file FCS nel software di analisi della citometria a flusso.
- Gate i macrofagi in base alle loro caratteristiche di dispersione diretta e laterale (FSC e SSC) ed escludono le cellule morte mediante gating di cellule vive/morte utilizzando il colorante di vitalità Zombie-UV.
- Visualizzare i macrofagi infetti da H37Rv-GFP nel canale FITC.
- Identificare la frequenza delle cellule colorate positivamente e l'intensità di fluorescenza media geometrica (MFI) per tutti i marcatori (Tabella 1).
Tabella 1: Elenco degli anticorpi utilizzati per la citometria a flusso.
| laser | filtro | fluorocromo | fenotipo | funzione | clone | N. catalogo | società |
| 639 | 670/30 | AF647 | TLR2 | Recettore di riconoscimento dei patogeni | TL2.1 | 309714 | BioLeggenda |
| 639 | 780/60 | APC-Cy7 | CD206 | Recettore del mannosio | 15-2 | Codice 321120 | BioLeggenda |
| 405 | 610/20 | BV605 | CD163 | Recettore spazzino | GHI/61 | 333616 | BioLeggenda |
| 405 | 670/30 | BV650 | CD80 | Molecola co-stimolatrice | 2D10 | 305227 | BioLeggenda |
| 405 | 710/50 | BV711 | CCR7 | Recettore delle chemochine | G043H7 | 353228 | BioLeggenda |
| 405 | 780/60 | BV785 | CD86 | Molecola co-stimolatrice | IT2.2 | 305442 | BioLeggenda |
| 488 | 530/30 | Valentina | Mtb | Batteri intracellulari | | | |
| 561 | Codice: 586/15 | Pe | CD200R | Recettore inibitorio | OX-108 | 329306 | BioLeggenda |
| 561 | Codice: 620/14 | PE/DAZZLE 594 | CD64 | Recettore Fc gamma-I delle IgG | 10.1 | 305032 | BioLeggenda |
| 561 | 661/20 | PE-Cy5 (PC5) | HLA-DR | Molecola MHC di classe II | L243 | 307608 | BioLeggenda |
| 355 | 450/50 | BUV395 | Colorante vitale | Marcatore di cellule vive/morte | Zombie UV | 423108 | Invitrogen |