Un test in vitro per studiare la capacità citotossica delle cellule killer indotte da citochine

Abstract

Fonte: Hsiao, C. H., et al. Isolamento ed espansione delle cellule T killer indotte da citochine citotossiche per il trattamento del cancro. J. Vis. Exp. (2020).

Questo video dimostra una tecnica in vitro per misurare la capacità citotossica delle cellule killer indotte da citochine (CIK) contro le cellule tumorali. Dopo la co-coltura di cellule tumorali bersaglio con cellule CIK, le cellule tumorali morte vengono identificate utilizzando un colorante fluorescente di vitalità e vengono quantificate utilizzando la citometria a flusso, stimando l'effetto citotossico delle cellule CIK.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.

1. Preparazione dei materiali

1. Conservare i reagenti, gli anticorpi e le sostanze chimiche come indicato nella scheda di sicurezza dei materiali (MSDS). Sciogliere i farmaci o le citochine in solventi come soluzioni madre e quindi aliquotare per lo stoccaggio a -20 °C o -80 °C.
   nota: Informazioni dettagliate per la preparazione del materiale sono riportate nella Tabella dei materiali.

2. Isolamento delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC)

1. Riscaldare la soluzione del gradiente di densità (Tabella dei materiali) a 18-20 °C prima dell'uso. Capovolgere più volte il flacone della soluzione per garantire una miscelazione accurata.
2. Raccogliere 3-5 mL di campione di sangue venoso umano in una fiala eparinizzata e mescolare bene capovolgendo delicatamente la provetta più volte.
3. Preparare 4 mL di soluzione a gradiente di densità in una provetta sterile da 15 mL.
4. Sovrapporre con cura 1 mL di campione di sangue sulla soluzione a gradiente di densità.
5. Centrifugare a 400 x g per 30 minuti a 18-20 °C (chiudere la pausa).
6. Aspirare con cautela e immediatamente lo strato di buffy coat di cellule mononucleate (circa 1 mL) per evitare di disturbare gli strati in una provetta sterile da 15 mL utilizzando una pipetta sterile da 1 mL.
7. Aggiungere almeno 3 volumi (~3 mL) di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) al buffy coat nella provetta da centrifuga. Sospendi le cellule pipettandole delicatamente su e giù almeno 3 volte con una pipetta sterile.
8. Centrifugare a 400 x g per 10 minuti a 18-20 °C. Aspirare il surnatante.
9. Sospendere il pellet cellulare con 5 mL di terreno basale (Tabella dei materiali) e trasferirlo in un pallone. Coltura delle cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di CO₂.

3. Introduzione ed espansione della CIK

1. Il giorno 0, coltivare le PBMC (1 x 10⁶) in terreno basale fresco contenente 1.000 UI/mL di IFN-γ per 24 ore in un incubatore per colture cellulari umidificato a 37 °C e 5% di CO₂.
2. Il giorno 1, aggiornare il terreno con un terreno basale fresco contenente 50 ng/mL di anticorpi anti-CD3, 1 ng/mL di IL-1α umana ricombinante (rh) e 1.000 U/mL di IL-2 rh. Rinfrescare il terreno ogni 3 giorni.
3. Il giorno 7, rinfrescare il terreno con terreno basale fresco contenente 1.000 U/mL di rh IL-2. Rinfrescare il terreno ogni 3 giorni fino alla fine dell'espansione della cella (Giorno 14).

4. Immunofenotipizzazione per la valutazione delle cellule CIK

1. Lavare le cellule CIK con 10 mL di PBS sterile. Centrifugare per 10 minuti a 300 x g e 18-20 °C, aspirare il surnatante e risospendere le cellule con 10 mL di PBS. Contare il numero di cellule e testare la vitalità delle cellule utilizzando il test di esclusione del blu di tripano.
2. Aliquotare le cellule CIK in sei provette sterili da 1,5 mL a una densità di ~5-10 x 10⁵ cellule/mL di PBS. Etichettare e trattare come segue: provetta 1, bianco (senza anticorpi); Provetta 2, aggiungere 20 μL di isotipo IgG1-FITC; Provetta 3, aggiungere 20 μL di anticorpi monoclonali dell'isotipo IgG1-APC; Provetta 4, aggiungere 20 μL di CD3-FITC; Provetta 5, aggiungere 20 μL di anticorpi monoclonali CD56-APC; e la provetta 6, aggiungere 20 μl di CD3-FITC e 20 μl di mAb CD56-APC.
3. Mescolare delicatamente le cellule CIK con gli anticorpi pipettandole delicatamente su e giù almeno 3 volte con una pipetta sterile da 1 ml, quindi incubare per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.
4. Centrifugare le provette per 10 minuti a 300 x g e 18-20 °C. Aspirare il surnatante e sospendere il pellet cellulare una volta con 1 mL di PBS. Pipettarli delicatamente su e giù almeno 3 volte con una pipetta sterile da 1 mL.
5. Ripetere il passaggio 4.4.
6. Lasciare le provette al buio prima dell'analisi citofluorimetrica.

5. Riconoscimento del marcatore CD

1. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 5 mL di polistirene a fondo tondo con un tappo per filtro cellulare (maglia da 100 μm) pipettando delicatamente attraverso il tappo. Metti in ordine i tubi sulla giostra.
2. Aprire il software di analisi della citometria a flusso e creare una cartella sperimentale. Fare clic sul pulsante Nuovo campione per aggiungere un campione e una provetta all'esperimento e denominare le provette come segue: Tubo 1, Vuoto; provetta 2, isotipo IgG1-CD3; Provetta 3, isotipo IgG1-CD56; Tubo 4, CD3; Tubo 5, CD56; Tubo 6, CD3CD56.
3. Creare un sistema di dispersione per le popolazioni di cellule CIK (Figura 1A).
   1. Seleziona Tubo 1 (vuoto) e fai clic sul pulsante Dot Plot per creare un grafico FSC-A/SSC-A. Disegna un gate rettangolare sull'intera popolazione cellulare con una soglia FSC-A >5 x 10⁴ per escludere i detriti cellulari.
   2. Selezionare il parametro SSC-A/SSC-H per il nuovo dot plot e disegnare un gate poligonale attorno a tutte le singole celle. Selezionare i parametri Conteggio/FITC (CD3) e Conteggio/APC (CD56) rispettivamente per il nuovo grafico dell'istogramma. Selezionare il parametro FITC (CD3)/APC (CD56) per il nuovo dot plot e disegnare una porta a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni.
   3. Registra i dati di 20.000 singole cellule in ogni campione. Fare clic sul pulsante Carica campione per analizzare prima il campione di controllo vuoto. Identificare l'intera popolazione di cellule CIK utilizzando i parametri dei canali CD56 e CD3.
4. Ripetere il passaggio 5.3 per l'indagine di tutti i campioni.
5. Aprire i file contenenti i valori statistici del singolo campione per analizzare le popolazioni di cellule CIK e ristamparli in file di analisi.

6. Coltura e colorazione di cellule K562 di leucemia mieloide cronica umana e di cellule OC-3 di cancro ovarico

1. Celle K562
   1. Coltura di cellule K562 in terreno completo (terreno basale RPMI contenente il 10% di siero fetale bovino [FBS] e 50 U/mL di antibiotici e regolazione del glucosio a 4,5 g/L) a una densità di 0,5-1 x 106 cellule/mL in un pallone di coltura cellulare e incubazione in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO₂.
   2. Trasferire i terreni di coltura contenenti le cellule K562 in provette sterili da 50 mL e pellettare le cellule a 300 x g per 10 minuti a 18-20 °C il giorno dell'esperimento.
   3. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in 5 mL di PBS sterile e mescolare bene delicatamente.
   4. Pellettare le cellule a 300 x g per 10 minuti. Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in PBS e regolare le cellule K562 a una concentrazione di 0,5-1 x 10⁶ cellule/mL.
   5. Aggiungere 0,5 μL di colorante carbossifluoresceina succinimidil estere (CFSE) a 1 mL di sospensione cellulare K562 in una provetta sterile da 15 mL a una concentrazione finale di 5 μM. Mescolare delicatamente la sospensione pipettando su e giù almeno 3 volte.
   6. Lasciare la provetta in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di CO₂ per 10-15 minuti.
   7. Aggiungere 9 mL di PBS alla provetta e pellettare le cellule a 300 x g per 10 min. Decantare il surnatante e quindi sospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno completo. Trasferire la sospensione cellulare in un pallone per colture cellulari e metterla nell'incubatore.
2. Cellule OC-3
   1. Coltura di cellule OC-3 in terreno completo (terreno DMEM/F12 contenente il 10% di FBS e 50 U/mL di antibiotici) a una densità di 0,5-1 x 10⁶ cellule in un pallone di coltura cellulare a 37 °C e 5% di CO₂.
   2. Aspirare i terreni di coltura e lavare le cellule con PBS 1 giorno prima dell'esperimento.
   3. Staccare le cellule aggiungendo 1 mL di soluzione dell'enzima di dissociazione cellulare (Tabella dei materiali) e incubare per 5 minuti a 37 °C.
   4. Sospendere le cellule aggiungendo 5 mL di PBS e mescolare bene delicatamente. Pellettare le celle a 300 x g per 10 min e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in PBS e regolare le cellule a una concentrazione di 0,5–1 x 10⁶ cellule/mL.
   5. Aggiungere 0,5 μl di colorante CFSE a 1 mL di sospensione cellulare OC-3 in una provetta sterile da 15 mL a una concentrazione finale di 5 μM. Miscelare delicatamente la sospensione pipettando su e giù almeno 3 volte.
   6. Lasciare la provetta in un incubatore per colture cellulari a 37 °C e 5% di CO₂ per 10-15 minuti.
   7. Aggiungere 9 mL di PBS alla provetta e pellettare le cellule a 300 x g per 10 minuti. Decantare il surnatante e quindi sospendere il pellet cellulare con il terreno completo. Seminare 5 x 10⁵ cellule/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti e incubare in un'incubatrice umidificata a 37 °C e 5% di CO₂ per una notte.

7. Saggio citotossico

1. Cocoltura di cellule CIK e K562 (CIK-K562)
   1. Contare le cellule K562 del passaggio 6.1.7 e testare la vitalità cellulare mediante il saggio di esclusione del blu di tripano. Aggiungere 1 mL di cellule K562 a ciascun pozzetto in una piastra a 6 pozzetti a una densità di 5 x 10⁵/mL.
   2. Aggiungere 1 mL di terreno basale con o senza cellule CIK del passaggio 3.4 alla piastra a 6 pozzetti del passaggio 7.1.1 come segue: Pozzetto 1 = vuoto, solo cellule K562 (5 x 10⁵); Pozzetto 2 = solo cellule K562 colorate con CFSE (5 x 10⁵); Pozzetto 3 = cellule CIK (E [effettore], 25 x 10⁵) + cellule K562 colorate con CFSE (T [bersaglio], 5 x 10⁵); Pozzetto 4 = cellule CIK (E, 50 x 10⁵) + cellule K562 colorate con CFSE (T, 5 x 10⁵).
   3. Miscelare le sospensioni cellulari pipettandole delicatamente su e giù almeno 3 volte. Posizionare la piastra nell'incubatore per 24 ore.
2. Cocoltura di cellule CIK e OC-3 (CIK-OC-3)
   1. Aggiungere 1 mL di terreno basale con o senza cellule CIK del passaggio 3.4 alla piastra a 6 pozzetti del passaggio 6.2.7 come segue: Pozzetto 1 = vuoto, solo cellule OC-3 (5 x 105); Pozzetto 2 = solo cellule OC-3 colorate con CFSE (5 x 10⁵); Pozzetto 3 = cellule CIK (E, 25 x 10⁵) + cellule OC-3 colorate con CFSE (T, 5 x 10⁵); Pozzetto 4 = cellule CIK (E, 50 x 10⁵) + cellule OC-3 colorate con CFSE (T, 5 x 10⁵).
   2. Miscelare le sospensioni cellulari pipettandole delicatamente su e giù almeno 3 volte. Mettere la piastra nell'incubatore per 24 ore.
3. Colorazione con colorante 7-amminoattinomicina D (7-AAD)
   1. Raccogliere la sospensione cellulare CIK-K562 dalla fase 7.1.3 direttamente in una provetta sterile da 15 mL.
   2. Raccogliere sia le cellule in sospensione che quelle aderenti dai gruppi CIK-OC-3 dal passaggio 7.2.2.
      1. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 mL. Lavare il pozzetto con 1 ml di PBS sterile, raccogliere il PBS e aggiungerlo alla provetta. Aggiungere 0,5 mL di soluzione dell'enzima di dissociazione cellulare e incubare per 5 minuti a 37 °C.
      2. Aggiungere 1 mL di soluzione dalla stessa provetta al pozzetto corrispondente e mescolare delicatamente le cellule pipettandole su e giù almeno 3 volte con una pipetta sterile da 1 mL. Raccogli tutte le cellule nella stessa provetta.
   3. Centrifugare a 300 x g per 10 minuti, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di PBS sterile. Pellettare le cellule a 300 x g per 10 minuti, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 100 μL di PBS sterile.
   4. Aggiungere 5 μl di colorante 7-AAD (50 ng/μl di stock) alla sospensione cellulare. Mescolare delicatamente le cellule pipettandole su e giù almeno 3 volte con una pipetta sterile da 1 ml. Incubare per 10 minuti e lasciare al buio prima dell'analisi.
4. Saggio di capacità citolitica
   1. Mescolare la sospensione cellulare del passaggio 7.3.4 e ripetere una volta i passaggi 5.1 e 5.2.
   2. Fare clic sul pulsante Nuovo campione per aggiungere un campione e una provetta all'esperimento e denominare le provette come segue: solo provetta 1, celle K562 (o OC-3); Provetta 2, solo celle K562 (o OC-3) colorate con CFSE; Tubo 3, E:T = 5:1; Tubo 4, E:T = 10:1.
   3. Creare un sistema di dispersione per il saggio citolitico (Figura 2A).
      1. Seleziona Tubo 1 e fai clic sul pulsante Dot Plot per creare un grafico FSC-A/SSC-A. Disegna un gate rettangolare su tutti gli eventi con una soglia FSC-A >5 x 10⁴ per escludere i detriti cellulari.
      2. Selezionare il parametro SSC-A/CFSE per il nuovo grafico a punti. Selezionare il parametro 7-AAD/CFSE per il nuovo grafico a punti e disegnare una porta a quattro quadranti per definire le quattro sottopopolazioni.
      3. Fare clic sul pulsante Carica campione per analizzare prima il campione di controllo vuoto.
      4. Regolare la tensione di SSC-A e FSC-A. Identificare la popolazione di cellule morte utilizzando i parametri dei canali CFSE e 7-AAD. Registra i dati da >20.000 cellule CFSE+ in ogni campione.
   4. Ripetere il punto 7.4.6 per l'indagine di tutti i campioni.
   5. Apri i file contenenti i valori statistici di ogni singolo campione per analizzare le popolazioni cellulari non vitali ed esportare i dati in file di analisi.

Risultati

Figura 1: La proporzione di cellule T CD3⁺CD56⁺ da un campione rappresentativo di PBMC. (A) I linfociti sono stati riconosciuti in base alle dimensioni e alla granularità specifiche. Popolazione di singole cellule selezionata per l'analisi mediante citometria a flusso. (B) L'analisi statistica dell'efficacia dell'espansione della CIK da tre donatori sani è stata ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
7-ammino attinomicina D	Bd	559925
Anticorpo anti-umano CD56 del topo APC	Bd	555518	B159
APC Mouse IgG1, controllo isotipo κ	Bd	555751	MOPC-21
Citometro a flusso BD FACSCanto II	Bd	338962		SN: R33896202856
Carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE)	Bd	565082		Ricostituzione del colorante CFSE (500 mg) con 90 mL di DMSO
Soluzione di D-(+)-glucosio	sigma	G8644		Per colture cellulari K562. Aggiungere 12,5 mL a 500 mL di terreno completo
Aquila modificata di Dulbecco Medium/F12	HyClone	SH30023.02		Terreno basale per colture cellulari OC-3
Siero fetale bovino	HyClone	SH30084.03		Per colture cellulari K562 e OC-3. Il terreno completo contiene il 10% di FBS
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare Scienze della vita	71101700-EK		Soluzione del gradiente di densità
FITC Anticorpo CD3 umano di topo	Bd	555332	UCHT1
FITC IgG1 di topo, controllo isotipo κ	Bd	555748	MOPC-21
MAb anti-CD3 umano	Takara	T210	OKT3	Aggiungere 2,5 mL di brodo (1 mg/1 mL) a 50 mL di terreno di induzione. Stock di stoccaggio a -80 °C
Penicillina-Streptomicina	Gibco	15140122		Aggiungere 5 mL di brodo (10.000 U/mL) a 500 mL di terreno completo. Scorte di stoccaggio a 4 °C.
Proleuchina	NOVARTIS			Ricostituzione della polvere di proleuchina (22x106 UI) con 1,2 mL di acqua sterile e aggiunta di 2,7 mL a 50 mL di terreno di induzione. Scorte di stoccaggio a -20 °C
Interferone-gamma umano ricombinante	CellGenix	Codice 1425-050		Ricostituzione di rh IFN-g (5x105 UI/50 μg) con 200 μL di acqua sterile e aggiunta di 20 mL a 50 mL di terreno di induzione. Scorte di stoccaggio a -20 °C
Interleuchina-1 alfa umana ricombinante	PEPROTECH	200-01A		Ricostituire rh IL-1α (10 μg) con 1 mL di acqua sterile e aggiungere 5 mL a 50 mL di terreno di induzione. Scorte di stoccaggio a -20 °C
RPMI1640 medio	Gibco	Codice 11875-085		Terreno basale per coltura cellulare K562. Scorte di stoccaggio a 4 °C
Centrifuga Sigma 3-18K	sigma	Codice 10295
Enzima TrypLE Express	Gibco	12605028		Enzima di dissociazione cellulare; Per il distacco delle cellule aderenti. Conservazione a temperatura ambiente
X-VIVO 15 medio	Lonza	04-418Q		Terreno basale per cellule PBMC e CIK. Stoccaggio a 4 °C