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Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Preparazione del reagente
- Preparare la soluzione madre per la raccolta dell'intero tessuto: 1 L di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 110 mL di Siero Fetale Bovino (FBS), 11 mL di Penicillina-Streptomicina (concentrazione finale 1%) e 1,1 mL di insulina sterilizzata con filtro (concentrazione finale 0,1%) Conservare la soluzione madre a 4 °C.
- Preparare il tampone chelante #1: 30 ml di terreno di coltura (come descritto in 1.1), 600 μl di acido etilendiamminotetraacetico 0,5 M (EDTA) (concentrazione finale 10 mM), 300 μl di gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 μl di amfotericina B (concentrazione finale 0,2%). Conservare la soluzione madre a 4 °C.
- Preparare il tampone chelante #2: 30 ml di terreno di coltura (come descritto in 1.1), 300 μl di EDTA 0,5 M (concentrazione finale 5 mM), 300 μl di gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 μl di amfotericina B (concentrazione finale 0,2%). Conservare la soluzione madre a 4 °C.
- Preparare terreni di minigut umano: 41,4 mL di DMEM/F-12, 5 mL di FBS (10% finale), 500 μL di penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%), 500 μL di L-glutammina (concentrazione finale 1%), 500 μL di gentamicina (concentrazione finale 1%), 100 μL di amfotericina B (concentrazione finale 0,2%), 500 μL di acido N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano solfonico 1 M (HEPES) (concentrazione finale 10 mM), 500 μL di integratore 100x N-2 e 1 mL di integratore 50x B-27 meno vitamina A per un volume totale di 50 mL. Conservare la soluzione madre a -20 °C.
- Preparazione dei terreni di minigut umano Completa: 10 ml di terreni di minigut umano (preparati in 1.4), 10 μl di 100 μg/mL di Wnt3a (concentrazione finale 100 ng/mL), 10 μl di 100 μg/mL di Noggin (concentrazione finale 100 ng/mL), 10 μl di 1 mg/mL di R-spondina (concentrazione finale 1 μg/mL), 10 μL di 500 μg/mL di fattore di crescita epidermico (EGF) (concentrazione finale 50 ng/mL), 10 μL di 1 M N-acetilcisteina (concentrazione finale 1 mM), 10 μL di 10 mM Y-27632 (concentrazione finale 10 μM), 10 μL di 500 μM A-83 (concentrazione finale 500 nM), 10 μL di 10 mM SB202190 (concentrazione finale 10 μM), 100 μL di 1 M di nicotinamide (concentrazione finale 10 mM) e 1 μL di 100 μM [leu] 15-gastrina 1 (concentrazione finale 10 nM). Volume totale 10 mL. Conservare la soluzione madre a 4 °C.
nota: Le soluzioni devono essere utilizzate entro 48 ore.
2. Isolamento della cripta e placcatura da tessuto intero
- Al momento del prelievo in sala operatoria, posizionare il campione di tessuto intestinale tenue umano in soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) a freddo. Lavare il campione in DPBS freddo fino a quando non è libero da feci e sangue. Conservare il campione a 4 °C in RPMI 1640 Medium fino al momento dell'isolamento della cripta.
nota: Il tessuto non può essere conservato per più di 24 ore.
- Assicurarsi che il campione sia privo di feci e sangue. Utilizzando forbici da dissezione delicate, rimuovere il grasso in eccesso o le graffette/graffette chirurgiche, ecc. Pesare l'esemplare.
NOTA: Puntare a un pezzo di circa 0,75-2,5 g.
- Tagliare il campione in pezzi di 0,5 cm e metterlo in 30 ml di tampone chelante #1 (come preparato al punto 1.2).
- Agitare a bassa velocità per 15 minuti a 4 °C.
- Filtrare il tessuto attraverso un filtro cellulare da 100 μm e scartare il flusso.
- Aggiungere il fazzoletto a 30 mL di tampone chelante #2 (come preparato al punto 1.3).
- Agitare a bassa velocità per 15 minuti a 4 °C.
- Filtrare il tessuto attraverso un filtro cellulare da 100 μm e scartare.
- Scongelare 500 mL di matrice a membrana basale su ghiaccio per l'uso nella fase 2.8.
- Aggiungere il tessuto a 10 mL di DMEM freddo in una provetta conica da 50 mL e agitare energicamente a mano per 10 s.
- Filtrare attraverso un filtro cellulare da 100 μm e raccogliere il flusso (etichetta #1). Mantieni il tubo #1 sul ghiaccio.
- Aggiungere il tessuto ad altri 10 ml di DMEM freddo in una provetta conica separata da 50 ml e agitare energicamente con le mani per 10 secondi.
- Filtrare attraverso un filtro cellulare da 100 μm e raccogliere il flusso (etichetta #2).
- Ripetere altre due volte fino a quando non ci sono quattro tubi conici con flusso (tubi etichettati #1-4).
- Filtrare la provetta #1 attraverso un filtro cellulare da 100 μm e trasferire il flusso in una provetta conica da 15 mL (etichetta #1). Ripeti per #2-4.
- Centrifugare le provette #1-4 da 15 mL a 200 x g per 15 minuti a 4 °C.
- Nella cappa a flusso laminare, rimuovere il surnatante dai tubi #1-4 e gettarlo. Evita di interrompere la nuvola di tessuto immediatamente sopra il pellet, anche se ciò significa lasciare dietro di sé un po' di surnatante.
- Pipettando lentamente, mescolare il pellet con il surnatante rimanente nelle provette #1-4.
- Trasferire la miscela dalle provette #1-4 in un'unica provetta conica da 2 mL.
- Centrifugare la provetta conica a 200 x g per 20 min a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in 500 μL della matrice della membrana basale.
nota: Mantieni sempre la matrice della membrana basale sul ghiaccio e lavora rapidamente per i passaggi successivi. Questo prodotto polimerizza molto rapidamente a temperatura ambiente.
- Applicare 50 μl di sospensione di matrice di campione/membrana basale al centro di un pozzetto in una piastra a 24 pozzetti. Questo dovrebbe apparire a forma di cupola.
nota: L'uso di puntali per pipette refrigerati favorisce un trasferimento più fluido della sospensione, riducendo al minimo la polimerizzazione.
- Ripetere 9 volte per riempire 10 pozzetti totali.
- Posizionare la piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 °C con CO2 al 5% per 30 minuti per consentire la polimerizzazione.
- Aggiungere 500 μl di Human Minigut Media Complete (come preparato al punto 1.5) in ciascun pozzetto. Sostituire ogni 2 giorni.
- Raccogliere gli enteroidi dopo 5-10 giorni, quando viene visualizzata la gemmazione. Vedere i passaggi 4 e 5 per le istruzioni sulla raccolta.
3. Induzione della NEC sperimentale
- Aggiungere 10 μL di 5 mg/mL di lipopolisaccaride (LPS) a 500 μL di Human Minigut Media Complete (come preparato al punto 1.5) in ciascun pozzetto il giorno 0. Sostituire ogni 2 giorni fino al ritiro.