Saggio di adesione in vitro per rilevare l'aderenza delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili

In questo articolo

Abstract

Najmeh, S., et al. Isolamento e manipolazione semplificati di trappole extracellulari per neutrofili umani (NET). J. Vis. Exp. (2015)

In questo video, dimostriamo un test che utilizza la microscopia a fluorescenza per rilevare l'adesione delle cellule tumorali alle trappole extracellulari dei neutrofili (NET). Nei pozzetti di prova, c'è un notevole aumento del numero di cellule tumorali marcate in fluorescenza che aderiscono ai NET, mentre i pozzetti trattati con DNasi mostrano una ridotta adesione delle cellule tumorali ai NET.

Protocollo

1. Saggio di adesione statica delle cellule tumorali NET-

Aggiungere 100 μl della pasta NET precedentemente ottenuta per pozzetto in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti e lasciare rivestire i pozzetti O/N a 4 °C al buio.
Tra le 12 e le 20 ore successive, verificare al microscopio la formazione di un monostrato uniforme di NET privi di cellule sul fondo dei pozzetti (Figura 1). A questo punto, aspirare delicatamente tutto il materiale non aderente fuori dai pozzetti, facendo attenzione a non rompere il monostrato NET sul fondo.
Aggiungere 100 μl di soluzione bloccante dell'albumina sierica bovina (BSA) all'1% in ciascun pozzetto e lasciare agire per 1 ora a RT.
Staccare le cellule tumorali A549 da un pallone T-75 utilizzando 2 ml di soluzione di tripsina allo 0,25%. Una volta staccato, aggiungere 10 ml di terreno A549 alle cellule tripsinizzate e centrifugare a 450 x g a 4 °C per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere le cellule nel terreno per ottenere una concentrazione di 2 x10⁴cellule tumorali per 100 μl di terreno.
nota: Le cellule A549 sono state coltivate separatamente. In breve, le cellule sono state coltivate e mantenute in terreni DMEM F12 contenenti il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina e incubate a 37 °C 5% di CO₂. Una volta raggiunta la confluenza cellulare del 70-80%, queste sono state staccate utilizzando tripsina-EDTA allo 0,25% e risospese nello stesso mezzo sopra descritto.
Colorare le cellule tumorali utilizzando CFSE aggiungendo 1 μl di CFSE per ml di terreno e lasciandolo colorare a RT per 10 minuti. Dopo la colorazione, centrifugare a 450 x g a 4 °C per 5 minuti, quindi scartare il surnatante e risospendere le cellule nel volume iniziale del terreno per ottenere una concentrazione di 2 x10⁴ cellule tumorali per 100 μl di terreno.
Dopo 1 ora di blocco dei NET, aspirare delicatamente la soluzione bloccante e aggiungere 2 x10⁴cellule tumorali in un terreno, che equivale a 100 μl, per pozzetto sopra il monostrato NET e lasciarlo aderire per 90 minuti a 37 °C 5% CO₂. Aspirare delicatamente le cellule e aggiungere 100 μl di PBS a ciascun pozzetto per lavare le cellule non aderenti.
In alcuni pozzetti, aggiungere 1000U di DNAsi I per pozzetto per 10 minuti prima del lavaggio per degradare i NET. Questo servirà come controllo negativo. In altri pozzetti, aggiungere 100 μl di acqua sterile per pozzetto per 10 minuti, che servirà come controllo del veicolo (VC).
NOTA: Di solito vengono eseguite 3 repliche per condizione per aumentare la dimensione del campione.
Aspirare e scartare tutte le soluzioni nei pozzetti, lasciando sul fondo solo i NET e le cellule tumorali aderenti. Aggiungere 100 μl di soluzione di formaldeide al 4% per pozzetto per fissare le cellule tumorali aderenti a NETS e leggere il test al microscopio a fluorescenza (Figura 1). Tracciare e analizzare i risultati (Figura 2).

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Risultati

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Figura 1. NET Monolayer. Le immagini al microscopio ottico dei pozzetti a piastre a 96 pozzetti rivestiti con NET mostrano (A) un monostrato uniforme di NET in tutto il pozzetto rispetto a (B) un rivestimento inadeguato del pozzetto con uno strato interrotto di NET. Le barre della scala rappresentano 40 μm.