Colorazione delle cellule batteriche e preparazione per studi immunologici

Abstract

Fonte: Yang, J. et al., Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti.J. Vis. Exp. (2021)

Questo video mostra la colorazione e la preparazione di cellule batteriche per studi immunologici utilizzando un colorante fluorescente rosso. I batteri colorati vengono diluiti e risospesi in un mezzo di crescita per ottenere la concentrazione batterica desiderata per l'infezione della cellula ospite, che rappresenta la molteplicità dell'infezione.

Protocollo

1. Crescita batterica e colorazione

1. Eseguire tutto il lavoro batterico in una cabina di biosicurezza, laboratorio di biosicurezza di livello 2.
2. Inoculare tutte le colture batteriche, tra cui Pseudomonas aeruginosa (PAO1), Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Bacillus subtilis, ecc., dal brodo di glicerolo congelato e coltivarle in brodo di soia triptico (TSB, 3 mL) in un incubatore agitato a 37 °C durante la notte mantenuto a 250 giri/min.
3. Il giorno successivo, utilizzare una diluizione 1:100 della coltura notturna per inoculare una sottocoltura e farla crescere in TSB (1 mL) per 3 ore fino alla fase esponenziale, misurare la densità ottica, OD a 600 nm (OD₆₀₀) per confermare. Assicurarsi che l'OD₆₀₀ sia compreso tra 0,4 e 0,6.
4. Prima di eseguire il saggio di aderenza batterio-ospite, le diluizioni seriali della sospensione batterica su piastre di TSB-agar, incubarle per una notte a 37 °C e quindi stabilire le unità formanti colonie batteriche, CFU dal numero di colonie. Per P. aeruginosa, una OD₆₀₀ di 1,0 corrisponde a 2 x 10⁸ cellule batteriche vitali/mL, e per L. monocytogenes, una OD₆₀₀ di 1,0 corrisponde a 9 x 10⁸ cellule batteriche vitali/mL.
5. Raccogliere le colture batteriche in fase esponenziale mediante centrifugazione a 13.000 x g per 2 minuti a temperatura ambiente (RT), quindi lavarle una volta utilizzando 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS 1 mL). Risospendere i pellet batterici in 1 mL di 1x PBS e determinare le concentrazioni misurando OD₆₀₀ di sospensioni batteriche. Ad esempio, P. aeruginosa con OD₆₀₀ di 0,5 rappresenta una concentrazione di 1 x 10⁸ cellule batteriche/mL.
6. Colorare la sospensione batterica utilizzando un colorante fluorescente verde o rosso a RT per 30 minuti con una leggera rotazione al buio. A tal fine, aggiungere 2 μl di colorante colorante concentrato 500 volte in 1 mL di sospensione batterica per diluire il colorante di 1 volta. Per lavare via il colorante colorante, centrifugare i batteri colorati a 13.000 x g per 2 minuti e risospendere il pellet in 1 mL di 1x PBS tre volte.
   nota: Se nell'esperimento vengono utilizzati batteri marcati con fluorescenza (proteina fluorescente verde (GFP-), proteina fluorescente rossa (RFP-), mCherry-, ecc.), saltare questa fase di colorazione batterica. In questo protocollo sono stati utilizzati P. aeruginosa marcato con GFP e L. monocytogenes colorato con colorante fluorescente rosso.
7. Raccogliere le cellule batteriche colorate o i batteri marcati con GFP mediante centrifugazione a 13.000 x g per 2 minuti. Risospendere in terreno F-12K fresco (1 mL) e misurare il diametro esterno_{di 600} di ciascuna coltura. Diluire successivamente le colture alle concentrazioni desiderate in base alla molteplicità dell'infezione (MOI) e alla concentrazione della cellula ospite. Il volume finale utilizzato in questo esperimento è di 500 μL.
   nota: Ad esempio, se la concentrazione di cellule ospiti contata utilizzando la colorazione con Trypan Blue è 1 x 10⁵ cellule/mL, la concentrazione desiderata di cellule batteriche con un MOI di 100 sarà 1 x 10⁷ cellule/mL. La concentrazione di P. aeruginosa a 0,5 OD₆₀₀ è 1 x 10⁸/mL. Per ottenere la concentrazione desiderata, diluire la coltura di P. aeruginosa 10 volte e aggiungere 50 μl di coltura risospesa a 450 μl di terreno F-12K fresco.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10x PBS	VWR	45001-130
BactoView Live Rosso	Biozio	Numero 40101	Colorante antibatterico
centrifuga	Eppendorf	5810R
Coli			Stock da laboratorio
F-12k medio	ATCC	302004	Terreno di coltura cellulare A549
Siero fetale bovino	Corning	35-016-CV
L. monocytogenes			Collezioni NIST
OD600 DiluPhotometro	IMPLEN
P. aeruginosa			Scorte di laboratorio della dottoressa Lori Burrows
P. aeruginosa ΔpilA			Scorte di laboratorio della dottoressa Lori Burrows
S. agalactiae			Collezioni NIST
S. aureus	BEI	NR-46543
S. aureus ΔsaeR	BEI	NR-48164
S. rubidaea			Collezioni NIST
Brodo di soia tipico	Cellule di crescita	MBPE-4040