Rilevamento del legame della vitronectina alle superfici batteriche mediante citometria a flusso

In questo articolo

Abstract

Fonte: Singh, B. et al., Saggi per studiare il ruolo della vitronectina nell'adesione batterica e nella resistenza al siero.J. Vis. Exp.(2018)

Questo video dimostra il rilevamento dell'interazione della vitronectina con le proteine di superficie batteriche. L'analisi di citometria a flusso misura il segnale di fluorescenza di anticorpi marcati in fluorescenza legati alla vitronectina, confermandone la presenza sulla superficie batterica. Questa tecnica fornisce informazioni sulle interazioni ospite-patogeno e sulle potenziali terapie per le infezioni batteriche.

Protocollo

1. Analisi di Vitronectina, Vn come ligando proteico di superficie batterica

Rilevamento del legame Vn sulla superficie batterica mediante citometria a flusso
nota: Nella citometria a flusso, abbiamo utilizzato la dispersione laterale e la dispersione diretta per il gate degli eventi positivi. Per esaminare le interazioni con Vn, sono stati selezionati isolati clinici di Hif di tipo f e Hif (n=10) insieme a E. coli BL21 (DE3) come controllo negativo (Figura 1A).
1. Colture Hif isolati clinicamente in terreno di infusione cervello-cuore (BHI) integrato con 10 μg/mL di nicotinammide adenina dinucleotide (NAD) ed emina a 37 °C con agitazione a 200 giri/min. Utilizzare il terreno Luria-Bertani per coltivare E. coli. Raccogliere l'Hif a metà della fase logaritmica (densità ottica, OD₆₀₀= 0,3) e risospendere i batteri in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,2, contenente l'1% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA) (tampone bloccante; PBS-BSA). Regolare la sospensione a 10⁹ unità formanti colonie, CFU/mL.
2. Trasferire le aliquote contenenti 5 x 10⁶ CFU in 5 mL di provette di polistirene a fondo tondo (12 x 75 mm²) e aggiungere 1 mL di tampone bloccante. Centrifugare la sospensione a 3.500 × g a temperatura ambiente (RT) per 5 minuti per pellettare i batteri, quindi aspirare con cura per rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet.
3. Risospendere i pellet batterici con 50 μL di tampone bloccante contenente 250 nM Vn e incubare i campioni per 1 ora a RT senza agitare. Dopo l'incubazione, pellettare i batteri mediante centrifugazione a 3.500 x g per 5 minuti, quindi lavare i pellet tre volte utilizzando PBS e fasi di centrifugazione simili.
4. Al pellet batterico, aggiungere 50 μL di anticorpi policlonali (pAb) Vn umani primari di pecora alla diluizione 1:100 in PBS-BSA. Incubare la sospensione per 1 ora a RT, quindi lavare i batteri tre volte con PBS per rimuovere gli anticorpi non legati (come descritto al punto 1.1.3).
5. Successivamente, aggiungere 50 μl di PBS-BSA contenente pAb anti-pecora d'asino coniugati con isotiocianato di fluoresceina (FITC) (diluizione 1:100) e incubare a RT per 1 ora al buio.
6. Preparare un controllo in bianco incubando i batteri con solo tampone bloccante e pAb senza Vn.
7. Lavare i batteri tre volte con 1 mL di tampone bloccante e pellettare la sospensione mediante centrifugazione, come descritto nel paragrafo 1.1.2. Infine, risospendere il pellet batterico con 300 μL di PBS e analizzarlo mediante citometria a flusso.

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Risultati

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Figura 1: Il sierotipo f di Haemophilus influenzae lega Vn attraverso il PH espresso in superficie.(A) Risultati della citometria a flusso che mostrano il legame di Vn alle cellule degli isolati clinici di Hof. Ogni isolato clinico (5 x 10,⁶ CFU) è stato incubato con 250 nM di Vn umano. Il ligando legato è stato rilevato utilizzando pAb anti-Vn di...