Valutazione della fosforilazione delle proteine intracellulari indotta da citochine stromali mediante citometria a flusso fosfoidale

Abstract

Fonte: Coats, J. S., et al. Espressione di citochine esogene in xenotrapianti derivati da pazienti tramite iniezione con una linea cellulare stromale trasdotta da citochine. J. Vis. Exp. (123) (2017).

Questo video dimostra la valutazione della fosforilazione intracellulare delle proteine indotta da citochine stromali nelle cellule leucemiche. Queste proteine fosforilate intracellulari vengono quantificate utilizzando la tecnica della citometria a fosfoflusso.

Protocollo

1. Saggi di citometria a fosfoflusso per valutare l'attività della citochina prodotta dallo stroma

NOTA: Valuta il surnatante dallo stroma ingegnerizzato prima del primo esperimento per verificare la bio-attività rilevante della citochina generata dallo stroma per il singolo esperimento. Una volta convalidato lo stroma ingegnerizzato, non sono necessari ulteriori test a meno che non vengano introdotti stroma prodotto con un nuovo vettore.

1. Acquistate linee cellulari per leucemia MUTZ5 e/o MHH-CALL4 (TSLP responsive), citochine umane ricombinanti e anticorpi approvati per l'uso in saggi di citometria a fosfoflusso per rilevare bersagli di fosforilazione a valle appropriati.
2. Il surnatante raccolto da Thaw è stato prelevato dallo stroma di controllo e che esprime citochine.
3. Piastra le linee cellulari di leucemia in terreno R20 (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione di 0,2 x 10⁶ cellule per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 96 pozzetti. Piastra 3 pozzetti per condizione per consentire saggi in triplice copia. Incubare per 2 ore a 37 °C. Questo tempo consente la perdita di qualsiasi fosforilazione che si è verificata durante le condizioni di coltura precedenti.
   NOTA: 12 pozzetti per linea cellulare forniscono saggi in triplicato per ogni condizione sperimentale mostrata nella fase 1.4.
4. Dopo 2 ore di coltura, trasferire le cellule da ciascun pozzetto per separare le provette da 4 mL e centrifugare a 500 x g per 5 minuti, a 4 °C. Decantare il surnatante.
   1. Risospendere le cellule in 200 μL per ciascuna delle seguenti condizioni sperimentali (eseguire saggi in triplicato): 1) solo terreni di controllo negativi, 2) terreni di controllo positivi con citochine ricombinanti a concentrazioni saturanti (TSLP a 15 ng/mL, ecc.), 3) surnatante dello stroma di controllo dallo stroma di controllo e 4) citochina-stroma-surnatante dallo stroma produttore di citochine.
5. Incubare le cellule per la durata specificata da uno specifico dosaggio fosfo-commerciale (ad es. 30 minuti per fosfo-STAT5 in MUTZ5 o MHH-CALL4 in risposta a TSLP).
6. Centrifugare a 500 x g per 5 min a 4 °C e decantare il surnatante.
7. Eseguire la colorazione con citometria a flusso fosfodinamico secondo il protocollo del produttore e raccogliere i dati della citometria a flusso.
8. Analizza i dati della citometria a flusso.
   1. Gate su celle intatte in base alla diffusione della luce diretta (FSC, indica la dimensione della cella) e laterale (SSC, indica la granularità della cella).
   2. Determinare l'intensità fluorescente mediana (MFI) delle cellule intatte in ciascun campione. Confrontare l'MFI medio ottenuto dai valori triplicati del surnatante delle cellule stromali con quello dei controlli dei media positivi e negativi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pipette sierologiche da 10 mL	Falcone	357551
Provette coniche in polipropilene da 15 mL	pescatore	05-539-12
Provette coniche in polipropilene da 50 mL	Falcone	352098
Puntali per pipette da 1 ml	pescatore	2707509
Puntali per pipette da 200 μl	Denville Scientifico	P3020-CPS
Puntali per pipette da 10 μl	Denville Scientifico	P-1096-CP
Terreno di coltura cellulare "R20", % del volume totale (per 195 mL)			Ricetta di laboratorio
IM/IP, 76,84% (150 ml)	Mediatech	10-040-CV
FBS, 20,49% (40 ml)	Mediatech	35-011-CV
2 mM di L-glutammina, 1,02% (2 mL)	Mediatech	35-011-CV
1 mM di Na piruvato, 1,02% (2 mL
Penicillina-Streptomicina, 0,51% (1 mL	Mediatech	30-002-CL
2-mercaptoetanolo, 0,10% (0,1 M), 0,10% (200 μL)	Mp	190242
Biologics
Linea cellulare "CALL-4" MHH-CALL-4, leucemia umana da precursori delle cellule B	DSMZ	ACC 337
Linea cellulare MUTZ-5, leucemia umana da precursori delle cellule B	DSMZ	ACC 490
Proteina TSLP umana ricombinante	Sistemi di ricerca e sviluppo	1398-TS-010
Anticorpi citometrici a flusso (clone)*
Anti-topo CD45 FITC (30F11)	Miltenyi Biotec	130-102-778
CD127 PE (MB15-18C9) (nome alternativo è IL-7Rα)	Miltenyi Biotec	Codice 130-098-094
APC CD34 (8G12)	BD Bioscienze	340667
CD45 PE-Cy7 (HI30)	eBioscience	Codice 25-0459
Colorante di vitalità fissabile "FVD" eFluor 780	eBioscience	65-0865
Ig κ catena leggera FITC (G20-193)	BD Pharmingen	555791
Ig λ catena leggera FITC (JDC-12)	BD Pharmingen	561379
IgD PE (IA6-2)	BioLeggenda	348203
IgM PE-Cy5 (G20-127)	BD Bioscienze	551079
pSTAT5 PE, mouse anti-STAT5 (pY694)	BD Fosfoflusso	612567
Altri materiali e attrezzature
Software di analisi per citometria a flusso FlowJo	FlussoJo, LLC	Versione 10
*Tutti gli anticorpi sono anti-umani se non diversamente specificato.

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