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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione dei tessuti per la fissazione e l'inclusione di paraffina
NOTA: Le biopsie sono state prelevate da donne consenzienti sottoposte a cistoscopia con elettro-fulgurazione della trigonite per la gestione avanzata delle infezioni ricorrenti del tratto urinario (rUTI). La rUTI è definita come 3 infezioni del tratto urinario in 12 mesi. La raccolta della biopsia è stata eseguita in sala operatoria mentre il paziente era sotto anestesia dopo aver ottenuto il consenso informato del paziente. Tutti i campioni sono stati codificati e resi anonimi prima della sperimentazione.
- Ottenere una biopsia a coppa fredda (~1 mm3) dal trigono vescicale con pinza urologica tramite cistoscopio flessibile e posizionare immediatamente in un crioviale sterile da 2 mL contenente 1,5 mL di paraformaldeide (PFA) al 4% v/v preparata in 1x soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS).
NOTA: Il 4% di PFA in 1x PBS può essere preparato in anticipo e conservato a -20 °C fino al momento del bisogno.
- Fissare la biopsia per 6 ore a temperatura ambiente o per 16-24 ore a 4 °C.
NOTA: La durata della fissazione deve essere calcolata in base alle dimensioni del campione di tessuto e deve essere evitata un'eccessiva fissazione. Si sconsiglia l'uso della glutaraldeide come fissativo in quanto introduce l'autofluorescenza.
- In una cappa sterilizzata o in una cappa di biosicurezza, rimuovere il fissativo mediante pipettaggio e sostituirlo con 1,5 mL di soluzione fisiologica sterile tamponata con fosfato (PBS). Conservare i campioni a 4 °C per una notte o eseguire immediatamente il trattamento dei tessuti e l'inclusione della paraffina.
- Utilizzare un microtomo sterilizzato per sezionare blocchi di tessuto a uno spessore di 5 μm e far aderire sezioni di tessuto di paraffina ai vetrini del microscopio caricati. Sarà necessario un minimo di due vetrini per biopsia per il protocollo di ibridazione in situ (FISH) a fluorescenza (FISH) dell'RNA ribosomiale 16S (16S rRNA).
NOTA: Il tessuto bioptico deve essere disposto in sezione trasversale rispetto al piano di taglio per garantire la visualizzazione degli strati uroteliali in tutte le sezioni. Va inoltre notato che lo spessore della sezione deve essere ottimizzato per il rilevamento della comunità batterica. Sezioni più sottili o il campionamento di più sezioni seriali possono essere necessarie nel caso di infezioni in cui i batteri residenti nei tessuti sono estremamente scarsi (ad esempio, <1 batterio residente nei tessuti per 1.000 cellule di mammifero).
2. Ibridazione in situ a fluorescenza con sonde universali 16S rRNA
NOTA: Sono necessari due vetrini per biopsia. È necessario un vetrino per la sonda universale 16S rRNA e un vetrino per una sonda di controllo con una sequenza criptata. Questo è importante per distinguere il segnale vero dal segnale di fondo durante la microscopia poiché l'epitelio vescicale è autofluorescente in più canali. Oltre alla sonda scramble, il blocco con Sudan Black B allo 0,1% prima del montaggio può ridurre l'autofluorescenza di fondo inerente al tessuto.
- Preparazione dei reagenti e della cappa
- Pulire una cappa aspirante vuota (o una cappa di biosicurezza adeguatamente montata) con etanolo al 70%.
- Preparare il tampone di ibridazione composto da 0,9 M di cloruro di sodio (NaCl), 20 mM di Tris (idrossimetil) amminometano-cloridrato (Tris-HCl, pH 7,2), dodecil solfato di sodio 0,1% (SDS) in 10 mL di acqua filtrata sterile.
NOTA: L'acqua filtrata sterile può essere preparata facendo passare acqua distillata autoclavata attraverso un filtro da 0,22 μM. Il tampone di ibridazione può essere conservato a temperatura ambiente, ma la SDS può precipitare dalla soluzione. In caso di precipitazione di SDS, riscaldare la soluzione in un bagnomaria a 50 °C prima dell'uso.
- Preparare almeno 100 ml ciascuno di etanolo al 95% e al 90% in acqua filtrata sterile in bottiglie lavate e sterilizzate in autoclave.
- Sciogliere le sonde liofilizzate marcate in fluorescenza in 10 mM di Tris-HCl (pH 8,0) e 1 mM di tampone (EDTA) di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) preparati in acqua priva di nucleasi sterilizzata con filtro fino a una concentrazione finale di 100 μM. Preparare una diluizione di 1 μM in tampone TE da utilizzare in questo protocollo. Conservare sia le sonde concentrate da 100 μM che quelle ricostituite da 1 μM a -20 °C al riparo dalla luce.
NOTA: Non sciogliere le sonde con etichetta fluorescente in acqua. Il tamponamento è necessario per prevenire l'idrolisi del legame estere N-idrossisuccinimide (NHS) che coniuga il fluoroforo alla sonda nucleotidica.
- Pulire cinque barattoli Coplin con etanolo al 70% (EtOH), lasciare asciugare, etichettare come segue: xileni I, xileni II, 95% EtOH, 90% EtOH, acqua bidistillata (ddH2O) e riempire con 100 ml della soluzione appropriata. Ciò contribuirà a evitare confusione nei passaggi successivi.
- Deparaffinazione e reidratazione dei tessuti
- Nella cappa, posizionare due vetrini per biopsia in un rack verticale per vetrini.
- Posizionare una griglia verticale per vetrini nel barattolo xileni I Coplin (contenente 100 ml di xileni) per 10 minuti.
- Rimuovere la griglia per vetrini dagli xileni I e tamponare il fondo su un tovagliolo di carta per rimuovere gli xileni in eccesso. Mettere nel barattolo di xileni II Coplin per 10 min.
NOTA: Non lavorare mai con xileni al di fuori di una cappa aspirante certificata.
- Reidratare le sezioni di tessuto deparaffinizzato in lavaggi successivi con etanolo (95% e 90%) per 10 minuti ciascuno nei barattoli Coplin rispettivamente etichettati.
NOTA: Durante questa fase, riscaldare il tampone di ibridazione a 50-56 °C a bagnomaria.
- Rimuovere la griglia per vetrini dal lavaggio con etanolo al 90%, tamponare il fondo su carta assorbente per rimuovere l'etanolo in eccesso e metterlo nel barattolo ddH2O Coplin contenente 100 ml di ddH2O sterilizzato con filtro per 10 minuti.
- In attesa del lavaggio ddH2O, diluire le sonde a 10 nM in un tampone di ibridazione per creare la soluzione colorante. Preparare 150 μl di soluzione colorante per vetrino.
NOTA: Proteggere la soluzione colorante dalla luce avvolgendo i tubi in un foglio di alluminio e riponendoli in un cassetto. Quando si lavora con sonde con etichetta fluorescente sul piano di lavoro, è consigliabile spegnere le luci a soffitto quando possibile. Le sonde diluite nel tampone di ibridazione non devono essere riutilizzate.
- Ibridazione e controcolorazione
- Preparare una camera di umidificazione per ogni sonda posizionando il Kimwipe imbevuto e accartocciato e l'acqua sterile nel serbatoio di una scatola di puntali P1000. Posizionare la cartuccia del supporto della punta sulla parte superiore: è qui che si posizioneranno le diapositive.
NOTA: È importante utilizzare una camera di umidificazione per evitare che le sezioni bioptiche si secchino durante l'ibridazione. Va notato che le camere di umidificazione disponibili in commercio sono progettate per mantenere un'atmosfera stabile e umida. Tuttavia, la tecnica qui descritta controlla sufficientemente l'umidità a un costo sostanzialmente inferiore.
- Rimuovere i vetrini dal supporto per vetrini e posizionarli su un tovagliolo di carta fresco (con il fazzoletto rivolto verso l'alto). Usa un Kimwipe per asciugare il vetrino. Fare attenzione a tamponare delicatamente solo vicino (non sopra) la sezione della biopsia per allontanare l'acqua. Utilizzando una penna idrofobica, tracciare un bordo attorno alla sezione della biopsia e posizionare il vetrino con il lato del tessuto rivolto verso l'alto nella camera di umidificazione.
NOTA: Lavorare rapidamente in modo che i tessuti non si secchino prima dell'ibridazione.
- Posizionare la camera di umidificazione in un incubatore impostato a 50 °C. Pipettare 50-150 μl di soluzione colorante direttamente sopra il tessuto in modo che il rettangolo formato dal bordo idrofobico attorno al tessuto sia riempito. Fare attenzione a non aggiungere troppa soluzione per traboccare dal bordo idrofobo. Chiudere delicatamente la scatola.
- Incubare per una notte (~16 h) a 50 °C al buio. Se l'incubatrice ha una finestra, coprila con un foglio di alluminio per creare un ambiente buio.
NOTA: Per un segnale affidabile è necessaria una temperatura di ibridazione inferiore alla temperatura di fusione della sonda FISH. 50 °C è la temperatura ottimale per la sonda universale 16S rRNA, ma potrebbe non essere ottimale per altre sonde.
- La mattina seguente, preparare almeno 500 mL di tampone di lavaggio composto da 0,9 M di cloruro di sodio (NaCl) e 20 mM di Tris-HCl (pH 7,2) in ddH2O e sterilizzare con filtro in un flacone sterile con filtro sottovuoto. Scaldare a 50-56 °C a bagnomaria.
- Rimuovete i vetrini dalle camere di umidificazione e rimuovete con cura la soluzione di ibridazione rimanente con un Kimwipe. Posizionare i vetrini in uno scaffale verticale per la colorazione.
- Posizionare lo stendibiancheria in un barattolo Coplin opaco contenente 100 ml di tampone di lavaggio preriscaldato per 10 minuti. Se i barattoli Coplin non sono opachi (ad esempio, vetro), mettili al buio durante le fasi di incubazione, magari sotto una scatola o in un cassetto.
- Ripetere la fase di lavaggio due volte con il tampone di lavaggio fresco nei nuovi barattoli Coplin.
- Durante le fasi di lavaggio, preparare il controcolorante diluendo una soluzione madre da 100 μg/mL di Hoechst 33342 1:1.000 nel tampone di lavaggio. Alla stessa provetta, aggiungere l'agglutinina del germe di grano (WGA) Alexa-555 a una concentrazione finale di 5 μg/mL e la falloidina Alexa-555 a una concentrazione finale di 33 nM. Conservare al buio fino al momento dell'uso.
NOTA: Hoechst, Alexa-555 WGA e Alexa-555 Phalloidin etichettano rispettivamente l'acido desossiribonucleico (DNA), la mucina/uroplachine e l'actina e possono essere conservati a lungo termine al buio secondo le istruzioni del produttore. Le etichette fluorescenti utilizzate per le sonde e i controcoloranti possono essere personalizzate per i set di filtri disponibili per il microscopio da utilizzare.
- Rimuovi le diapositive dall'ultimo lavaggio e rimuovi delicatamente il tampone di lavaggio in eccesso con un Kimwipe. Posizionare i vetrini con il fazzoletto rivolto verso l'alto su un tovagliolo di carta e aggiungere 50-150 μl di colorante di contrasto direttamente sopra il tessuto in modo che il bordo idrofobico sia riempito, ma non traboccante. Coprire fino a quattro vetrini con una parte superiore della scatola criogenica e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Riposizionare i lati nello scolapasta e lavare altre due volte in barattoli Coplin con tampone di lavaggio fresco, per 10 minuti ciascuno.
- Asciugare accuratamente i vetrini dopo l'ultimo lavaggio e posizionare il fazzoletto con il fazzoletto rivolto verso l'alto su un tovagliolo di carta sotto la parte superiore di una scatola criogenica. Spremere una goccia di terreno di montaggio direttamente sopra il tessuto. Posizionare delicatamente un vetrino coprioggetti di dimensioni adeguate (dipenderà dalle dimensioni della biopsia) sulla parte superiore. Premere delicatamente per eliminare eventuali bolle in quanto interferiranno con l'imaging e consentiranno ai vetrini scivolati di polimerizzare durante la notte al buio.
- Il giorno successivo, sigillare i bordi del vetrino coprioggetti sul vetrino con un leggero strato di smalto trasparente. Lasciare asciugare per 10 minuti al buio e poi conservare al buio a 4 °C per la microscopia confocale.
3. Visualizzazione di 16S rRNA FISH mediante microscopia confocale
NOTA: Per questo protocollo, i migliori risultati si ottengono con un microscopio confocale a scansione laser con obiettivi 63x e 100x. Sono necessari set di filtri adeguati per la visualizzazione della fluorescenza Hoechst, Alexa-488 e Alexa-555. Tuttavia, la microscopia fluorescente standard può essere utilizzata se non è disponibile un microscopio confocale. Questo protocollo è per un microscopio confocale a scansione laser.
- Accendere il microscopio confocale e il software del computer associato al microscopio secondo le istruzioni del produttore.
- Caricare la diapositiva e visualizzare con l'obiettivo 10x nel canale blu (Hoechst). Metti a fuoco con attenzione fino a quando i nuclei non sono visibili.
- Una volta messo a fuoco, impostare l'obiettivo su un ingrandimento elevato (63x o 100x). Aggiungere olio sopra il vetrino coprioggetti. Rimettere a fuoco con il nuovo obiettivo, assicurandosi che la lente dell'obiettivo entri in contatto con l'olio durante la messa a fuoco.
NOTA: Utilizzare solo la messa a fuoco fine ad alto ingrandimento (63x o 100x). L'olio deve essere utilizzato solo per un obiettivo petrolifero.
- Valutare rapidamente ogni vetrino attraverso l'oculare nel canale verde (proteina fluorescente verde potenziata, eGFP/Alexa-488) per determinare quali vetrini sono positivi per la FISH e quali negativi.
NOTA: È meglio se questa valutazione/punteggio iniziale viene eseguita in cieco da un individuo separato per ridurre il pregiudizio sperimentale.
- Per visualizzare le biopsie colorate, iniziare con un vetrino positivo FISH e passare alla modalità di visualizzazione computerizzata. Seleziona i canali 405 (Hoechst), 488 (Alexa-488) e 555 (Alexa-555). Impostare il foro stenopeico utilizzando il canale di lunghezza d'onda più lungo, in questo caso 555. Trova il piano focale corretto per la visualizzazione dei batteri marcati nel canale 488. Senza modificare il piano focale, impostare il guadagno, la potenza del laser e l'offset per ciascun canale in modo che il segnale non sia saturo e lo sfondo non sia eccessivamente corretto. Acquisisci l'immagine in tutti e tre i canali.
NOTA: Utilizzare le stesse impostazioni per il canale 488 per visualizzare ogni diapositiva in un esperimento. La potenza del laser può richiedere una regolazione nei canali 405 e 555 se il piano focale ottimale per la visualizzazione batterica cambia tra i campi.