Una tecnica in vitro per la generazione di cellule T apoptotiche mediata dall'irradiazione UV

Abstract

Fonte: Hodge, M. X., et al. Valutazione in vivo dell'efferocitosi dei macrofagi alveolari a seguito di esposizione all'ozono. J. Vis. Exp. (2019).

Questo video dimostra un metodo per indurre l'apoptosi nelle cellule Jurkat - una linea cellulare di leucemia di linfociti T umani. Le cellule sono esposte alle radiazioni ultraviolette C (UVC), che causano ingenti danni al DNA e portano alla morte cellulare apoptotica.

Protocollo

1. Preparazione della linea cellulare Jurkat T (Giorno 2)

NOTA: Tutte le procedure devono essere condotte in una cabina di sicurezza biologica di classe II.

1. Coltura di cellule T Jurkat in 24 mL di terreno di coltura cellulare basale + 10% FBS + 5% penicillina/streptomicina a 37 °C + 5% CO₂ (Tabella dei materiali). Le cellule T Jurkat sono una linea cellulare in sospensione che può essere mantenuta passando 1:6-1:8 in terreni di coltura preriscaldati ogni 3 giorni. Non agitare.
2. Per preparare le cellule apoptotiche, farle crescere fino al 90% di confluenza in ogni fiaschetta (che richiede 3-4 giorni per essere raggiunta dopo il passaggio). Per questo studio, utilizzare le cellule di cinque fiasche T75 per ottenere un numero sufficiente di cellule utilizzate in questo protocollo.
   nota: Un pallone confluente contiene circa 20-24 milioni di cellule.
3. Pipettare le cellule (che è l'intero pallone) da ciascun pallone (circa 24 ml) e trasferire le cellule in una provetta conica sterile da 50 ml utilizzando una pipetta sierologica. Utilizzare più tubi conici per più fiasche.
4. Contare le cellule rimuovendo un'aliquota di 11 μL di cellule dalla provetta conica da 50 mL e mescolarle con 11 μL di colorante blu di tripano e pipettare 11 μL sui vetrini dell'emocitometro.
5. Inserire il vetrino in un contatore automatico di cellule e registrare il numero di cellule vive per calcolare la conta totale delle cellule in ciascun pallone moltiplicando il numero di cellule vive per 24, poiché ogni pallone contiene 24 mL di terreno.
6. Centrifugare la sospensione della cella a 271 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) in celle a pellet.
7. Scartare il surnatante per aspirazione e risospendere il pellet cellulare in un terreno per ottenere 3,0 x 10⁶ cellule per mL.
8. Aliquotare 5 mL di cellule in piastre di coltura tissutale da 100 mm x 20 mm (verranno utilizzate circa nove piastre; la quantità totale di cellule in ciascuna piastra dovrebbe essere ~15 x 10⁶).
9. Utilizzare una parabola per il controllo/non esposta e le restanti stoviglie saranno esposte ai raggi UV.
10. Impostare il reticolante UV sul livello di energia corretto, premere il pulsante dell'energia e inserire "600" utilizzando il tastierino numerico, che la macchina leggerà come 600 μJ/cm² x 100,
    nota: Le unità di energia del reticolante UV sono in μJ/cm² x 100; pertanto, per ottenere 60 millijoule/cm², convertire le unità in modo che corrispondano al reticolante UV.
11. Irradiare tutte le piastre con cellule, escluso il controllo, a 60 millijoule (mJ)/cm² utilizzando il reticolante UV. Rimuovere il coperchio superiore delle piastre per colture tissutali durante l'esposizione ai raggi UV, poiché la luce UV non penetra nel coperchio di plastica.
12. Incubare tutte le piastre in un incubatore per colture cellulari, compreso il controllo non esposto, a 37 °C al 5% di CO₂ per 4 ore.
13. Confermare l'apoptosi mediante citometria a flusso utilizzando un kit di rilevamento del test di apoptosi contenente annessina V e ioduro di propidio (PI) (marcatori rispettivamente per apoptosi e necrosi) dopo 4 ore di incubazione, secondo le istruzioni del produttore.
    nota: L'irradiazione delle cellule T Jurkat nel reticolante UV a un livello di energia di 600 μJ/cm², dopo un'incubazione di 4 ore, porterà al ≥75% delle cellule apoptotiche (sia precoci che tardive) con un fenotipo apoptotico più precoce rispetto al fenotipo apoptotico tardivo. Ciò rende più facile per i macrofagi alveolari riconoscerli e inghiottirli poiché le loro membrane non sono compromesse, a differenza delle cellule apoptotiche tardive, portando a un indice efferocitico più elevato e a un imaging più accurato dell'efferocitosi dei macrofagi alveolari in questo studio.
    1. Raggruppare 333 μl (1 x 10⁶ cellule) di cellule T Jurkat da diverse piastre (sia "senza UV" che "esposte ai raggi UV") da utilizzare per le provette di analisi di compensazione.
    2. Aliquotare 333 μL di cellule T Jurkat in una singola colorazione di annessina V non colorata, una singola colorazione PI, nessun controllo UV e 600 μJ/cm² di provette per citometria a flusso marcate esposte ai raggi UV.
    3. Centrifugare le provette a 188 x g per 5 minuti a RT e decantare il surnatante.
    4. Lavare le celle mediante risospensione in 500 μL di soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS).
    5. Centrifugare e pellettare le celle a 188 x g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante dopo la centrifugazione.
    6. Preparare 400 μl di tampone legante 1x per provetta di flusso diluendo il tampone legante 10x con acqua distillata durante la centrifugazione delle cellule.
    7. Preparare l'annessina V e il reagente di incubazione PI (100 μl per campione/provetta) secondo le istruzioni del produttore.
    8. Decantare il surnatante dopo la centrifugazione e risospendere delicatamente tutte le provette in 400 μl di tampone legante 1x, quindi aggiungere 100 μl di reagente di incubazione dell'annessina V a ciascuna provetta del campione. Infine, aggiungere 100 μl di colorante singolo di annessina V e colorante singolo PI alle rispettive provette, ma non aggiungere nulla oltre il tampone legante 1x alla provetta non colorata.
    9. Incubare le provette al buio per 15 minuti a RT.
    10. Centrifugare tutte le cellule a 188 x g per 5 minuti a RT e decantare il surnatante.
    11. Risospendere le cellule in 400 μL di tampone legante 1x, quindi analizzare i campioni per l'apoptosi mediante citometria a flusso. Raccogli almeno 10.000 eventi per provetta per consentire una rappresentazione accurata della colorazione.
14. Combinare tutte le cellule irradiate dalle piastre in una provetta conica da 50 mL e le celle a pellet mediante centrifugazione a 271 x g per 5 minuti a RT.
15. Eliminare il surnatante dalla provetta mediante aspirazione e risospendere le cellule in 24 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) e le cellule in pellet mediante centrifugazione a 271 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
16. Scartare il surnatante dalla provetta mediante aspirazione e risospendere le cellule nella quantità di PBS utilizzata per il dosaggio dei topi approvata da IACUC. La dose utilizzata è compresa tra 5-10 x 10⁶ cellule/50 μL per topo; quindi, per 10 topi, risospendere in 500 μL (il numero di cellule in ogni dose varia a seconda di quante cellule vengono coltivate per l'irradiazione).
    nota: Effettuare almeno due dosi aggiuntive per tenere conto di eventuali liquidi che potrebbero attaccarsi ai lati del puntale della pipetta, con conseguente perdita di cellule.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit Annexin V-FITC	Trevigen	4830-250-K	Il kit TACS Annexin V-FITC consente un'identificazione rapida, specifica e quantitativa dell'apoptosi nelle singole cellule quando si utilizza la citometria a flusso.
Cellule T Jurkat BCL2	ATCC	ATCC CRL-2899	La linea cellulare BCL2 Jurkat è stata derivata trasfettando cellule T umane Jurkat con il vettore di espressione pSFFV-neo mammifero contenente l'inserto ORF BCL-2 umano e un gene resistente alla neomicina. È stato per modelli di misurazione dell'efferocitosi.
Contacellule automatizzato Countess II	Thermofisher	AMQAX1000	Si tratta di una piattaforma di analisi da banco dotata di ottiche all'avanguardia, messa a fuoco automatica completa e software di analisi delle immagini per la valutazione rapida delle cellule in sospensione. Molto facile da usare.
Citocentrifuga Cytospin 4	Thermofisher	A78300003	Fornisce preparazioni economiche a strato sottile da qualsiasi matrice liquida, in particolare fluidi ipocellulari come il liquido di lavaggio broncoalveolare.
Siero fetale bovino, qualificato, inattivato a caldo	Thermofisher	16140071	Fornisce nutrienti alle cellule in coltura per la loro crescita. È lo standard per la coltura cellulare.
Penicillina-Streptomicina	Sigma/Aldrich	P0781-100ML	La penicillina-streptomicina è la soluzione antibiotica più comunemente usata per la coltura di cellule di mammifero. Inoltre, viene utilizzato per mantenere le condizioni di sterilità durante la coltura cellulare.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplemento	Thermofisher	61870036	RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) è stato originariamente sviluppato per coltivare cellule leucemiche umane in sospensione e come monostrato. Da allora il terreno RPMI 1640 è stato trovato adatto per una varietà di cellule di mammifero, tra cui HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrociti e carcinomi. Aiuta a far crescere le cellule T Jurkat in modo rapido ed efficiente.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV reticolante	Cambridge Scientific	Codice: 16659	Il reticolante UV Stratalinker è progettato per indurre apoptosi, reticolare DNA o RNA in membrane di nylon, nitrocellulosa o nitrocellulosa rinforzata con nylon.